甜瓜果實成熟相關基因家族的全基因組鑒定及分析

郭呈宇，柳 俊，李園磊，安 睿，李星巖，哈斯阿古拉

(1.內蒙古大學 生命科學學院,牧草與特色作物生物技術教育部重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010070；2.內蒙古農牧業科學院 作物育種與栽培研究所，內蒙古 呼和浩特 010031)

乙烯作為一種重要植物激素參與多個植物生長發育過程和應答脅迫反應[1-2]。研究發現，乙烯合成存在2種系統，系統Ⅰ和系統Ⅱ[3]。系統Ⅰ完成基礎乙烯合成，主要存在于未成熟果實和營養生長的器官中，通過自身抑制的方式進行調控；而系統Ⅱ參與果實成熟和花衰老時乙烯的大量合成，通過自身催化的方式調控[4-6]。在番茄中，系統Ⅰ和系統Ⅱ由不同的ACO、ACS家族成員參與[4,7-8]。

乙烯合成關鍵酶ACO和ACS基因受到轉錄因子的調控。Lin等[9]發現1個亮氨酸拉鏈蛋白的同源蛋白LeHB1結合在番茄LeACO1基因啟動子9 bp 的AATA(A)TATT或10 bp 的AATA(AA)TATT特定序列上，對該基因進行轉錄水平調節。通過病毒介導的基因沉默技術，當LeHB1基因下調后，LeACO1基因的表達受到了抑制，果實的成熟也被延遲。Ito等[10]通過染色質免疫沉淀PCR檢測發現，番茄的1個MADS-box蛋白LeMADS-RIN(RIN)會特異性地結合到LeACS2啟動子的CArG box區域。rin隱性突變的番茄果實成熟發育出現障礙，致使該植株既無法大量產生內源性乙烯，又無法對外源乙烯做出應答，導致果實無法成熟[11]。RIN被認為是乙烯生物合成與調控中重要的上游調節蛋白。

乙烯進入細胞后，通過信號轉導途徑來調節植物各種生理活動。乙烯受體位于內質網膜上，它首先感受乙烯信號，目前已經鑒定的擬南芥乙烯受體共5個，即ETR1、 ETR2、 ERS1、ERS2、EIN4[12]。乙烯受體的下游組分CTR1也位于內質網膜上，與乙烯受體相互作用[13]。CTR1的C末端具有Ser/Thr激酶活性，而N末端可以與自磷酸化的乙烯受體如ETR1的組氨酸激酶域形成復合物，從而起到負調控乙烯信號轉導的作用[14]。

本研究在甜瓜全基因組范圍內鑒定了乙烯生物合成及信號轉導相關的4個基因家族HB(Homeo box)、RIN(Ripening inhibitor)、ETR(Ethylene receptor)和CTR(Constitutive triple reaction)，并進行了生物信息學分析。以甜瓜品種河套蜜瓜原種和內蒙古大學牧草與特色作物生物技術教育部重點實驗室培育的轉反義CmACO1基因的河套蜜瓜M9品系[15]為試驗材料，分析了上述基因在果實生長期和成熟期的表達特性，旨在為發掘與甜瓜果實成熟相關的基因。

1 材料和方法

1.1 植物材料

甜瓜品種河套蜜瓜原種由內蒙古大學牧草與特色作物生物技術教育部重點實驗室保存，轉反義CmACO1基因的河套蜜瓜M9品系(以下簡稱M9)由內蒙古大學牧草與特色作物生物技術教育部重點實驗室培育[14]。將2種材料播種于日光溫室，按常規方法進行栽培管理，盛花期人工自交授粉。采摘授粉后10 d(以下簡稱生長期)和30 d果實(以下簡稱成熟期)(圖1)，每個時間點每個材料采摘3顆果實，取中果皮組織，速凍于液氮，用于總RNA提取，進行轉錄組測序分析。

1.2 四個基因家族的全基因組鑒定

根據NCBI數據庫中已確認功能的基因序列，找到番茄LeETR1、LeMADS-RIN1、LeHB1基因和擬南芥AtCTR1基因作為探針基因，并查找各自對應的蛋白質序列(表1)，下載FASTA格式的序列文件。然后將該FASTA文件輸入InterPro數據庫進行分析，將探針基因中所有功能域所在區域的序列作為探針序列。再將探針序列分別輸入甜瓜基因組數據庫(MELONOMICS)的Blast工具中，獲得具有與目標功能域序列高度相似(E<10-10)序列的蛋白質登錄號并下載其FASTA格式文件。最后將甜瓜數據庫中篩選到的序列輸入InterPro數據庫中驗證，剔除功能域不完整的序列，獲得相應的基因家族成員。

A．M9生長期果實；B.河套蜜瓜原種生長期果實；C.M9成熟期果實；D.河套蜜瓜原種成熟期果實。A.M9 fruit at the growth stage; B.Hetao melon fruit at the growth stage; C.M9 fruit at the ripening stage; D.Hetao melon fruit at the ripening stage.

基因名稱Gene name登錄號Accession number序列描述Sequence description長度/bpLengthLeHB1350537501同源域亮氨酸拉鏈蛋白188LeMADS-RIN1350534764MADS盒轉錄因子異構體1149LeETR1350534616乙烯受體386AtCTR130680171CTR1絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶549

1.3 基因編碼蛋白的生物信息學分析

將鑒定獲得的蛋白序列使用DNAMAN 8.0軟件進行比對，獲得保守序列。使用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)在線軟件預測各基因家族蛋白序列的保守基序。

1.4 總RNA提取及轉錄組測序

使用康為世紀公司TRIzol總RNA提取試劑盒，按照說明書提取總RNA。對總RNA進行電泳檢測和純度檢測后交由北京諾禾致源科技股份有限公司完成轉錄組測序。

1.5 基因的表達量分析

從轉錄組測序結果中提取4個基因家族成員的表達量FPKM值(Fragments per kilobase of transcript per milion fragment mapped)，使用R 語言工具的 Pheatmap 拓展包繪制聚類熱圖(Heatmap)。篩選高表達基因，使用SPSS 22.0版本進行方差分析，獲得基因差異表達顯著性水平。

2 結果與分析

2.1 四個基因家族的全基因組鑒定

對4個基因在甜瓜中進行全基因組鑒定發現，CmETR家族有3個成員、CmCTR家族有20個成員，CmHB家族有17個成員，CmRIN家族有21個成員(表2)。

2.2 四個基因家族編碼蛋白氨基酸序列分析

對4個家族成員的序列進行比對，發現不同家族的氨基酸序列均存在較多的保守位點，序列相似性較高，說明基因家族鑒定結果是可靠的。CmETR家族的3個成員序列相似度較高，保守序列位點分布的位置較廣(圖2-A)，這暗示該家族可能存在多個保守基序。進一步對該家族保守基序分析發現，基序1，2，3，4的保守性較高(圖3-A)，這與序列比對結果具有一致性。蛋白質的低級結構決定高級結構，高級結構決定其功能。該家族成員具有較高的位點保守性，暗示其在甜瓜中的功能也可能非常相近。CmCTR家族保守序列集中在2個位置(圖2-B)，對其保守基序分析發現，基序1，2的保守性最高(圖3-B)，這2個保守基序可能是該家族基因共有的功能位點。CmHB和CmRIN兩家族的保守序列相對集中(圖2-C-D)，分別對2個家族的保守基序分析發現，CmHB的基序5(圖3-C)和CmRIN的基序6(圖3-D)都是非常保守，是這2個家族成員的典型特征序列。

表2 四個基因家族成員鑒定結果Tab.2 The identification of four gene families

A.CmETR家族氨基酸序列比對結果；B.CmCTR家族氨基酸序列比對結果；C.CmHB家族氨基酸序列比對結果；D.CmRIN家族氨基酸序列比對結果。A.Sequence alignment of CmETR family; B.Sequence alignment of CmCTR family; C.Sequence alignment of CmHB family; D.Sequence alignment of CmRIN family.

A.CmETR家族氨基酸序列比對分析結果；B.CmCTR家族氨基酸序列比對分析結果；C.CmHB家族氨基酸序列比對分析結果；D.CmRIN家族氨基酸序列比對分析結果。A.Motifs analysis of CmETR family; B.Motifs analysis of CmCTR family; C.Motifs analysis of CmHB family; D.Motifs analysis of CmRIN family.

2.3 四個基因家族在不同發育時期果實中的表達分析

對4個基因家族的表達量聚類結果(圖4)分析發現，CmETR、CmCTR和CmHB 3個家族成員在2個材料(M9和河套蜜瓜原種)中的表達量聚為兩類，即生長期的表達量聚為一類，成熟期的表達量聚為一類；而CmRIN家族的表達量分為3類，2個材料成熟期的表達量聚為一類，生長期的河套蜜瓜原種和生長期的M9的表達量各為一類。

CmETR家族3個成員中CmETR1基因在2個材料中的2個時期均有較高水平的表達，CmETR2和CmETR3則均表現出基因下調趨勢。

A.CmETR家族成員表達量熱圖；B.CmCTR家族成員表達量熱圖；C.CmHB家族成員表達量熱圖；D.CmRIN家族成員表達量熱圖；DF_M_group_fpkm.M9生長期果實；DF_C_group_fpkm.河套蜜瓜原種生長期果實；RF_M_group_fpkm.M9成熟期果實；RF_C_group_fpkm.河套蜜瓜原種成熟期果實。

A.Heatmap of CmETR family expression; B.Heatmap of CmCTR family expression; C.Heatmap of CmHB family expression; D.Heatmap of CmRIN family expression; DF_M_group_fpkm.M9 fruit at the growth stage; DF_C_group_fpkm.Hetao melon fruit at the growth stage; RF_M_group_fpkm.M9 fruit at ripening stage; RF_C_group_fpkm.Hetao melon fruit at ripening stage.

圖4 四個基因家族在不同發育時期果實中表達量的熱圖
Fig.4 Heatmap of the four gene families expression in different fruits

CmCTR的20個成員中CmCTR1、CmCTR12在原種和M9的生長期果實中的表達水平均略高于成熟期，CmCTR15則具有相反表達模式。CmCTR8和CmCTR20在2個材料的果實中均有表達，在生長期和成熟期的表達量沒有明顯變化。CmCTR2在M9的成熟期果實中的表達水平略高于河套蜜瓜原種。CmCTR17和CmCTR5在河套蜜瓜原種中下調，而在M9材料中表達上調，但需要進行統計分析。CmCTR7在河套蜜瓜原種與M9中2個時期的表達趨勢變化相同，均呈現上調。

CmHB家族17個成員中CmHB4和CmHB9的表達在2個材料中均表現出上調，其中CmHB4在生長期幾乎不表達，在成熟期果實中則大量表達。CmHB12和CmHB15則與CmHB4表達模式相反，其在2個材料中均表現下調。CmHB3在2個材料的成熟期果實中均有微量表達。CmHB5在2個材料的生長期果實中均有較高水平的表達。CmHB11在2個材料中均明顯表現下調模式。CmHB13在河套蜜瓜原種的2個時期表達水平均很低。

CmRIN家族的21成員中CmRIN2在2個材料的表達量表現出一致的下調模式，但其表達水平較低。CmRIN3在不同發育時期果實中的表達水平整體較高且表現出上調。CmRIN14和CmRIN15在2個材料成熟期果實中的表達水平相近，但在不同材料中的表達模式相反。CmRIN18的表達水平整體較低。

2.4 四個家族基因表達差異分析

篩選FPKM值大于1的所有基因，對其不同發育時期果實中的表達量進行方差分析，由圖5可看出，河套蜜瓜原種2個時期顯著差異表達的基因有13個，除了CmHB5以外，其余12個基因的表達量在M9的2個時期也呈顯著性差異。這12個基因分別是：CmETR2、CmETR3、CmCTR12、CmHB3、CmHB4、CmHB9、CmHB11、CmHB12、CmHB15、CmRIN2、CmRIN14、CmRIN15。進一步分析發現，在河套蜜瓜原種中CmHB3和CmHB11生長期的表達量是成熟期的42，9倍，而CmHB4成熟期的表達量是生長期的27倍，其表達量均呈極顯著差異；在M9中CmHB3和CmHB11生長期的表達量是成熟期表達量的6,3倍，而CmHB4成熟期的表達量是生長期的41倍，其表達量均呈極顯著差異。

另外發現，在生長期2個材料間有5個基因呈顯著性差異表達，其中除了CmHB11基因外，其余3個基因的表達量在成熟期的2個材料間也呈顯著性差異，這3個基因分別是CmHB3、CmRIN14、CmRIN15，其中CmHB3、CmHB4的表達量呈極顯著差異。

10 d河套.河套蜜瓜原種生長期的果實；30 d河套.河套蜜瓜原種成熟期的果實；10 d M9.M9生長期的果實；30 d M9.M9成熟期的果實；不同小寫字母a,b,c,d代表存在顯著性差異；不同大寫字母A,B,C,D代表存在極顯著差異；字母相同則無差異。

10 d Hetao.Hetao melon fruit at growth stage; 30 d Hetao.Hetao melon fruit at ripening stage; 10 d M9.M9 fruit at growth stage; 30 d M9.M9 fruit at ripening stage; There was significant difference between a, b, c, d; There was highly significant difference between A, B, C, D; The same letters means no difference.

圖5 基因表達差異性分析
Fig.5 Difference analysis of gene expression

3 結論與討論

果實成熟的眾多調控因子中，乙烯被認為是最關鍵的影響因子[16]。果實成熟時包括細胞壁代謝、類胡蘿卜素合成、葉綠素降解、芳香物質、糖和有機酸合成等多個代謝途徑的相關基因都受乙烯調控[17]。乙烯通過信號轉導來調控植物體內的生理活動[18]。利用轉錄組測序的方法對目標基因家族的表達量檢測具有成本低、高通量的優勢，是目前挖掘功能基因的主要手段之一[19]。本研究選取在果實發育和成熟中已報道的4個相關基因作為目標基因，在甜瓜基因組中鑒定獲得其家族成員。對這些基因在河套蜜瓜原種和M9品系不同發育時期果實中的表達量分析，發現CmETR家族成員在成熟過程的表達水平在河套蜜瓜原種和M9中都呈下調趨勢。Ciardi等[20]發現乙烯受體在乙烯信號通路中是通過負調控來傳遞信號的，ETR的表達水平降低可提升植株對乙烯的敏感性。此外，CmCTR12基因在果實發育過程中顯著差異表達，且后期呈下調模式，這與姚遠等[21]在甜瓜中克隆的Cm-CTR1基因具有相同的表達模式。

本研究中13個基因在河套蜜瓜原種的2個時期存在顯著差異表達，12基因在M9的2個時期存在顯著差異表達，其中CmHB3和CmHB11呈下調表達模式且不同時期的表達量存在極顯著差異，推測其可能在生長期起作用；而CmHB4呈上調表達模式且不同時期的表達量存在極顯著差異，推測其可能在成熟期發揮作用。在生長期的河套蜜瓜原種和M9中，5個基因的表達量存在顯著差異，其中CmHB3和CmHB11的表達量在不同材料間存在極顯著差異；而在成熟期的河套蜜瓜原種和M9中，4個基因的表達量在2個材料間存在顯著差異，其中CmHB3和CmHB11的表達量在不同材料間存在極顯著差異，推測在果實發育過程中CmACO1的表達影響CmHB3和CmHB11的表達水平。番茄中LeHB1基因表達的抑制導致LeACO1基因的表達也降低[9]，而本研究中發現CmHB3和CmHB112個基因在轉反義CmACO1基因的材料中的表達量顯著低于河套蜜瓜原種，暗示甜瓜中CmACO1基因的表達也影響CmHB基因的表達水平。另外，CmRIN14和CmRIN15的表達量在河套蜜瓜原種和M9中存在截然相反的情況，表明其表達模式受CmACO1表達水平的影響。