馬鈴薯StPR1基因克隆及表達特異性分析

李秀鈺，賀付蒙，韓瑛琪，趙瀟璨，武佳文，朱元芳，周 磊，石奇海，馮 哲，李鳳蘭

(東北農業大學 生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

馬鈴薯(Solanumtuberosum)在中國的糧食作物中扮演著重要的角色，出現在人類四季的飲食中。因此，馬鈴薯需要進行較長時間的窖儲，這為真菌、細菌、病毒和線蟲在內的病原體提供了侵染馬鈴薯的機會。馬鈴薯的病害主要包括枯萎病、粉痂病、干腐病、青枯病、軟腐病、早疫病、晚疫病、瘡痂病等，這些病害大大降低了馬鈴薯的質量[1-2]。對于病害的防治一般選用抗病品種和無病種薯進行合理種植；在病害田間噴灑噻菌靈、戊唑醇和咯菌腈等化學藥劑進行防治；利用轉基因技術獲得抗病馬鈴薯[3-4]。

病程相關蛋白(Pathogenesis related protein，PR蛋白)是指植物在其受到生物或非生物的脅迫后所誘導產生并積累的一類蛋白總稱[5]，在發生病原體攻擊時在植物中產生的蛋白質，被誘導為系統獲得性抗性的一部分。其中一些蛋白質是抗菌的，可以攻擊細菌或真菌細胞壁中的分子，并且一些蛋白質可作為病菌感染的傳播信號。感染還刺激細胞壁中分子的交聯和木質素的沉積，為反應建立了局部路障，減緩了病原體擴散到植物的其他部分[6-8]。

PR基因家族劃分為1～17個家族[9]。在新鮮番紅花柱頭克隆CsPR10基因，發現其具有抵抗黃萎病菌(Verticilliumdahliae)、青霉菌(Penicillium)和尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)的能力[10]。表達分析表明，花藥和苔蘚組織中存在高轉錄水平，這種蛋白質似乎通過激活茉莉酸途徑參與主動防御反應。在煙草中對PR-la基因進行研究，證明該基因在煙草花葉病毒和水楊酸誘導性中發揮著重要的作用[11]。在克隆煙草發病相關PR1基因及在煙草中的表達研究表明，銅和鋅處理對煙草PR基因表達的誘導，其參與SA信號轉導途徑[12]。在煙草感病品種中克隆NtPR10基因，發現該基因在TMV感染過程發生上調，表明其具有重要功能[13]。PR1能夠響應各種病原體并誘導該基因表達。它是SAR(系統性獲得抗性)響應的有效分子標記，該基因的表達是水楊酸響應性的[14-16]。

目前，馬鈴薯抗病問題已經成為病理學家研究的重點內容，而對于馬鈴薯中PR基因與馬鈴薯抗病的關系研究較少。本研究以馬鈴薯大西洋品種為研究材料，克隆了StPR1基因，對該基因進行相關的生物信息學分析，進而更加明確該基因的功能；應用qRT-PCR技術，針對該基因在真菌、細菌及毒素脅迫下的表達特異性及差異，進而為馬鈴薯的生物防治奠定堅實的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及處理

植物材料為馬鈴薯(大西洋品種)，由黑龍江省農業科學院提供。

菌株材料真菌為接骨木鐮孢(F.sambucinum)、燕麥鐮孢(F.avenaceum)以及導致軟腐病和青枯病等的細菌胡蘿卜軟腐歐文氏菌(E.carotovorasubsp.CarotovoraBorgey，Ecc)、菊歐氏菌(E.chrysanthemiBurkholder.AtrosepticaDye，Ech)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌馬鈴薯黑脛亞種(E.carotovorasubsp.McFaddenetDimock，Eca)、茄科雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum，RS)由東北農業大學植物資源與分子生物學研究室保存并提供。

選取大小均勻、表面光滑、無病斑的馬鈴薯，清水洗凈馬鈴薯表面，隨后將馬鈴薯置于75%的酒精中30 s，然后使用5%的NaClO溶液中浸泡5 min，最后使用無菌水清洗3次，置于超凈工作臺中備用。使用打孔器在馬鈴薯表面打下直徑為1 cm，深度為2 cm的孔洞，將300 μL Ecc、Eca、Ech、RS菌液、接骨木鐮孢及燕麥鐮孢菌餅注入到孔洞中，以無菌水為對照。分別在處理0，4，12 h后進行取樣，沿著孔洞的直徑將馬鈴薯切兩半，取孔洞周圍的組織0.5～0.6 g，重復3次，用錫箔紙包好，液氮中速凍，置于-80 ℃保存、備用。

RNA提取選用Bio Teke試劑盒購于恒誠生物公司；DNA膠回收選用OMEGA試劑盒購于賽拓生物公司；RT-PCR的熒光染料SYBR Green、TopTaq酶、pEASY-T3克隆載體、大腸桿菌感受態DH5α、質粒提取試劑盒、反轉錄試劑盒購于全式金生物公司；試驗所需引物合成于哈爾濱博仕生物公司；試驗結果測序于庫美生物公司；LB肉湯、LB營養瓊脂、NaClO溶液購于恒誠生物公司；使用Primer Premire 5.0(Premier Biosoft)進行引物設計。

1.2 RNA提取及cDNA的合成

用Bio Teke試劑盒(RP3301)進行總RNA 的提取，分裝進行UV-240紫外分光光度計濃度測定，OD260/280為1.8～2.0，測定合格后放入-80 ℃保存備用，瓊脂糖凝膠電泳對RNA的完整性進行檢驗。選用Oligo(DT)為引物，對提取的RNA進行反轉錄，將反轉錄產物cDNA置于-20 ℃保存備用，使用β-actin對cDNA質量進行檢測。

1.3 StPR1基因的克隆

根據NCBI上公布的馬鈴薯病程相關蛋白PR1(XM-006367029.2)，找到CDS區，使用Primer Premire 5.0進行PR1克隆引物的設計(PR1-F：ATG GGATACTCCAATATTGCCTT；PR1-R：TTAGATATC AGTTGGAAGTTCCAAC)，克隆記憶長度為540 bp。以DON處理12 h的cDNA為模板進行PCR擴增反應，將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，進而將目的片段進行膠回收，并于pEASY-T3進行連接，并將連接產物轉化到大腸桿菌感受態DH5α中，使用含有Amp(氨芐青霉素)(100 mg/mL)的LB營養瓊脂培養基進行菌落篩選，隨機挑取較圓、大小均勻的單菌落30個，待菌液渾濁進行菌液PCR驗證，將出現目的基因的菌液送公司進行測序。

1.4 StPR1生物信息學分析

利用以下生物信息學分析軟件以及在線工具對PR1基因進行相關分析。①保守結構域分析：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi；②開放閱讀框及氨基酸序列分析：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder；③蛋白質信號肽預測：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/；④蛋白一級結構的預測及分析：http://web.expasy.org/protparam/；⑤蛋白質疏水性及親水性預測：https://web.expasy.org/protscale/；⑥蛋白質二級結構的預測：https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html；⑦蛋白質三級結構預測：https://swissmodel.expasy.org/；⑧蛋白序列亞細胞定位：http://www.softberry.com；⑨系統發育樹：MEGA 5.0。

1.5 StPR1表達特異性分析

根據PR1的CDS區進行表達特異性的qRT-PCR的引物設計(表1)，將1.1中的6種處理及無菌水為對照的cDNA進行稀釋，并以馬鈴薯肌動蛋白β-actin內參基因，進行qRT-PCR擴增反應，其中包含3次生物學重復，其反應體系為上下游引物各0.5 μL，cDNA 1.0 μL，2×Trans Star Top Green Qpcr Super Mix 10 μL，進行實時熒光定量分析。采用比較CT法(ΔΔCT)對熒光定量PCR擴增數據進行處理。

1.6 數據統計分析

試驗數據錄入及分析采用Microsoft Excel 2010，作圖采用GraphPad Prism 5。相對表達量計算方法為2-ΔΔCT=2-(ΔCT處理-ΔCT對照)=2-((CT處理-CT內參)-(CT對照-CT內參))。使用Excel進行數據整理及處理。

表1 引物設計Tab.1 Primers design

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯StPR1基因的克隆

根據馬鈴薯PR1(GenBank 登錄號：XM-006367029.2)設計引物，進行PCR擴增，將產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，可以獲得500 bp左右的目的條帶(圖1)，進行該目的基因的測序，獲得540 bp序列，并將其進行生物信息學分析。

M.DNA分子量標準2000；1-2.PCR產物。M.DL2000 DNA Marker；1-2.The PCR production.

2.2 馬鈴薯StPR1基因生物信息學分析

對已經克隆的StPR1基因進行生物信息學分析，發現該基因具有一個SCP_PR-1_like結構域，位于79-480 bp(圖2)；該基因序列的起始密碼子ATG位于1 bp處，終止密碼子位于540 bp處，共編碼179個氨基酸，該基因全長540 bp；其開放閱讀框ORF1可翻譯蛋白質序列；對其進行蛋白質信號肽預測，發現PR1蛋白含有信號肽，屬于分泌蛋白；對PR1蛋白進行一級結構預測及分析、PR1蛋白氨基酸含量預測及蛋白質疏水性及親水性預測，PR1蛋白序列的GRAVY值在+4～-3，含有親水區及疏水區；蛋白質二級結構預測其屬于混合型蛋白；蛋白質三級結構預測發現其為緊密復雜的螺旋結構(圖3)；預測蛋白質存在的位置，發現StPR1基因編碼的蛋白在細胞膜以及細胞外基質，在細胞質、線粒體、內質網、高爾基體、過氧化物酶體、高爾基體、葉綠體有分布。

圖2 StPR1基因保守結構域分析Fig.2 Analysis of conserved domain of StPR1 gene

圖3 蛋白質三級結構預測Fig.3 Protein tertiary structure prediction

2.3 馬鈴薯StPR1基因的系統進化樹構建

使用MEGA 5.0進行StPR1基因的系統進化樹構建，結果表明馬鈴薯與辣椒PR1基因在一個進化分支上，相似性較高(圖4)。

2.4 馬鈴薯StPR1基因表達特異性分析

利用已經獲得的RNA為模板進行反轉錄，使用qRT-PCR進行熒光定量分析。該基因的表達在茄科雷爾氏菌侵染下呈先下調后上調的趨勢；該基因的表達在接骨木鐮孢侵染下無明顯波動，而在燕麥鐮孢的侵染下呈逐漸上調的趨勢，12 h該基因的表達量顯著高于0 h；該基因的表達在軟腐病致病菌Ecc侵染下顯著高于Ech、Eca侵染下該基因的表達，并且在Ech、Eca侵染條件下StPR1基因呈下調趨勢，且此3組處理各個時間點的表達量均低于對照組。StPR1在參與馬鈴薯抗病過程中，抗真菌的能力可能強于抗細菌的能力(圖5)。

圖4 StPR1與其他物種的PR1基因系統發生分析Fig.4 Analysis of PR1 gene system in StPR1 and other species

圖5 不同脅迫下StPR1基因的表達差異Fig.5 Differential expression of StPR1 gene under different stresses

3 結論與討論

近年來，馬鈴薯產業的發展受到了各種病害的嚴重制約，化學防治已經被廣泛地應用到馬鈴薯的種植以及儲存過程中，與此同時生物防治也得到了廣泛的關注。楊德翠等[17]在以牡丹為研究材料，對PsPR1進行克隆及抗病研究，發現該基因受牡丹柱枝孢葉斑病病原菌(C.canadense)和信號物質SA的顯著誘導，其與抗真菌的關系比較密切，分別在處理的12,24 h達到最高峰，這一研究表明，PsPR1可能參與了牡丹的抗病防御過程。張青等[18]對大薯中的PR1進行克隆，并對該基因進行生物信息學分析，表明該基因編碼的蛋白具有典型SCP_PR-1_like保守結構域,Blast比對表明，DaPR1蛋白與多種植物的PR1蛋白高度同源。王樂等[19]在東方百合的相關研究中獲得了LhSorPR1，并證明PR1蛋白在結構和功能上與其他植物中的PR1蛋白具有較強的保守性。馬立功等[20]在以向日葵為研究材料，成功克隆了向日葵PR1基因，對該基因進行生物信息學分析發現,開放閱讀框為489 bp,編碼162個氨基酸,經比較HaPR1與多種物種PR1高度同源并預測其具有抗核盤菌的功能。本試驗成功地從馬鈴薯大西洋品種中克隆出StPR1基因，在對其核苷酸序列進行生物信息學分析后發現，雖然該基因與NCBI上公布的StPR1存在幾處差異，但其保守結構域沒有受到任何影響，該蛋白典型的SCP_PR-1_like結構域仍然存在。

病程相關蛋白的抗細菌以及真菌的能力也成為相關研究的熱點。發現轉CpPR4基因植株對蛙眼病病菌有一定抗性[21]。肖棟等[22]、李雪姣等[23]在對不結球白菜病程相關蛋白基因研究表明，BcPR5在IPTG誘導4 h后能實現融合蛋白的高效表達，證明該基因在抗霜霉病防御反應中發揮著重要作用，并且推測這些PR蛋白質參與水稻白葉枯病菌抗病過程。ABA和SA處理后強烈誘導TcLr19PR1，其中TcLr19PR1的表達水平顯著增加并在12，72 h達到最大值，發現TcLr19PR1基因在小麥發育和抗葉銹病病原體攻擊中起重要作用[24-25]。PR1蛋白具有抗真菌能力和免疫抑制能力[26]。根據本試驗的結果預測StPR1基因對抗干腐病的能力可能強于軟腐病和青枯病。