核桃內果皮4-香豆酸輔酶A連接酶基因克隆及表達分析

郭永翠，秦江南，朱 玲，張 銳

(1.塔里木大學 植物科學學院, 新疆 阿拉爾 843300;2.新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300; 3.南疆特色果樹高效優質栽培與深加工技術國家地方聯合工程實驗室，新疆 阿拉爾 843300；4.新疆伊犁州農業科學研究所, 新疆 伊寧 835000)

新疆核桃(JuglansregiaL.)殼薄、早實豐產、出仁率高且種仁飽滿，其中紙皮核桃品質尤為突出，成為近年消費熱點[1]。紙皮核桃殼厚小于1 mm (大多在0.5～0.8 mm)，出仁率達65%以上，種仁飽滿，內果皮發育完整，其中溫138核桃是紙皮核桃栽培園中發現的突變株，其平均出仁率高達83.2%，產量極高，果殼極薄、極易脫皮，但殼面(內果皮發育不完整)開裂導致露仁，是適于核桃深加工的優質種質資源[2-3]。

木質素是核桃內果皮(硬殼)的主要成分，且是內果皮中難分解的大分子有機物質，其沉積出現在次生加厚的細胞壁中以提高細胞壁的強度及硬度，對核桃內果皮發育影響較大[4-5]。其中4CL是起到連接木質素前體及各個分支反應作用的關鍵限速酶，在木質素生物合成途徑中4CL分別催化對-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸生成相應的輔酶A酯，促進木質素單體的合成[6-7]。通過活化基團生成相應輔酶A酯，從而促進木質素單體生成單加氧酶[8]。目前已從慈竹(Neosinocalamusaffinis)[9]、青稞(Hullessbarey)[10]、亞麻(LinumusitatissimumL.)[11]、芒果(Mangiferaindica)[12]、白樺(Betulaplatyphylla)[13]、甜高粱(Sorghumdochna(Forssk.)Snowden)[14]等多種植物中克隆并編碼4CL基因，在擬南芥、煙草、白楊、毛白楊等植物的研究中發現，抑制4CL基因表達會引起植物體內木質素含量顯著降低，其中S/G比值卻會根據植物種類的不同而有所差異，在擬南芥植株中G-木質素的含量顯著降低，在煙草植株中S-木質素的含量顯著降低，而在白楊中植株S/G卻沒有明顯變化[15-16]。然而關于溫138核桃露仁現象及其與之相關的核桃內果皮硬化過程中木質素沉積的系統分子機制尚不明確。

本研究擬通過對溫138、紙皮核桃內果皮木質素生物合成途徑中關鍵酶4CL基因進行克隆及時空表達模式的分析來研究4CL基因的表達特性，旨在為進一步研究4CL基因在核桃不同發育時期的表達模式及為核桃內果皮木質素的基因改造提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料露仁核桃溫138及硬殼發育完整紙皮核桃，均采自新疆維吾爾自治區溫宿縣核桃木本糧油林場。在果實膨大期后期6月7日(約花后51 d)至硬核期7月26日(約花后100 d)采樣，采樣覆蓋整個核桃內果皮硬化期。

1.2 核桃內果皮總RNA提取及cDNA合成

利用EZNA Plant RNA Kit試劑盒(Omega公司)提取核桃內果皮中總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳方法檢測及鑒定PCR產物的濃度、純度和亮度。采用cNDA合成試劑盒反轉錄合成cDNA。

1.3 核桃內果皮4CL基因的克隆

利用Premier 5.0設計引物，溫138核桃引物4CL-F：5′-TCAACTTGGAAGACCAGCAGCCA-3′及4CL-R：5′-AGCCTCCGCTCTCACCAGCA-3′，RT-PCR反應體系20 μL。擴增條件：94 ℃/3 min(預變性)；94 ℃ 45 s(變性)，61 ℃ 45 s (退火)，72 ℃ 2 min (延伸)，31個循環；72 ℃ 8 min (繼續延伸)；4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物并成像，后將擴增的目的條帶進行回收并連接到PMD-18T載體，篩選出陽性克隆測序。

1.4 4CL基因生物信息學分析

根據WJ-4CL、ZJ-4CL基因序列，推導氨基酸序列,采用NCBI數據庫Blast功能進行在線4CL序列匹配度、同源性分析；ORF Finder檢測cDNA序列的開放閱讀框；采用MAGA 5.1軟件(Neighbor-Joining)構建4CL基因與其他相似性高的植物的系統進化樹。運用ExPASy數據庫ProtParam功能分析核桃內果皮WJ-4CL、ZJ-4CL蛋白的相對分子質量、氨基酸數量及理論等電點等相關理化性質。采用PredictProtein在線平臺分析4CL蛋白二級結構，選用在線同源服務軟件SWISS-MODEL預測4CL蛋白質三維結構。

1.5 4CL基因的表達分析

以18S為內參，采用實時熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測4CL基因的相對表達量。根據已克隆的核桃內果皮木質素4CL基因序列，按照標準熒光定量PCR引物原則，分別設計溫138、紙皮核桃4CL基因熒光定量PCR引物，露仁種質溫138核桃PCR引物4CL-WF：5′-AATCTCGGTGTTGGGAAGG-3′，4CL-WR：5′-CTTTGGAGGATTTCGCTTG-3′；硬殼完整種質紙皮核桃PCR引物4CL-ZF：5′-CTTGCTACTCAC CCATCCTAAC-3′，4CL-ZR：5′-CACTTGATCGCACC ACAAAA-3′；內參基因引物：NBQ-F：5′-AGTCGTAA CAAGGTTTCCGTAGGT-3′；NBQ-R: 5′-GCTGGGCAG GTATCGACAAT-3′。以溫138及紙皮核桃8個時期的cDNA為模板，采用兩步法進行Real-time PCR擴增，反應體系10 μL。擴增條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，40個循環；熔解曲線生成步驟：58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s,55 ℃ 20 min,95 ℃ 15 s。利用2-ΔΔCt方法[17]分別計算4CL基因在硬殼完整和露仁核桃內果皮發育過程中的表達量。

2 結果與分析

2.1 核桃內果皮總RNA的提取及檢測

核桃內果皮中總RNA凝膠成像呈現較清晰完整的28S rRNA和18S rRNA條帶，5S rRNA條帶較模糊，28S rRNA的亮度是18S rRNA的2倍，測得核酸濃度A260/280為1.90～2.20，說明提取的總RNA有較高的純度(圖1)。

2.2 核桃內果皮4CL基因的克隆

以溫138和紙皮核桃內果皮總RNA反轉錄后的cDNA為模板進行RT-PCR反應(圖2)，得到露仁核桃WJ-4CL基因及硬殼完整核桃ZJ-4CL基因。WJ-4CL基因片段長度為1 000 bp (含有552 bp的ORF)，編碼184個氨基酸，分子質量20.10 ku，理論等電點5.83，屬于酸性蛋白；ZL-4CL基因片段長度1 000 bp (含有453 bp的ORF)，編碼151個氨基酸，分子質量16.52 ku，理論等電點9.35，屬于堿性蛋白。

圖1 電泳檢測核桃內果皮總RNAFig.1 Electrophoresis of total RNA from walnut endocarp

M.DL2000 DNA Marker; 1.溫138核桃; 2.紙皮核桃。M.DL2000 DNA Marker; 1.Wen 138 walnut; 2.Zhipi walnut.

A.WJ-4CL基因的結構域分析; B.ZJ-4CL基因的結構域分析。A.Domain analysis of WJ-4CL gene; B.Domain analysis of ZJ-4CL gene.

2.3 4CL基因生物信息學分析

2.3.14CL基因序列分析 將本研究獲得的2個基因相似性進行分析，發現與其他植物4CL基因序列有較高的匹配度。結果顯示，核苷酸序列與光皮樺、白樺、歐洲白樺的4CL基因序列匹配度最高，其相似性達到83%以上，其中均與光皮樺的匹配度最高，相似性分別達到86%，83%。經NCBI數據庫BlastP在線分析可知，WJ-4CL和ZL-4CL與光皮樺、白樺等其他植物推導氨基酸序列相似性均在70%以上。4CL推導氨基酸序列發現,WJ-4CL與ZL-4CL均存在一個4CL非特異性位點，WJ-4CL基因推導氨基酸序列存在PLN02246、AMP-binding、CaiC及ligase_PEP_1 4個功能結構域，ZL-4CL基因推導氨基酸序列含有cyc_hxne_CoA_lg、PLN02246、CaiC及AMP-binding 4個功能結構域，WJ-4CL與ZL-4CL推導氨基酸序列均為多結構域蛋白(AFD_class_Ⅰ)超家族(圖3)。

2.3.24CL基因系統進化樹分析 將本研究獲得的WJ-4CL、ZJ-4CL基因核苷酸序列進行多重序列比對(圖4)，露仁種質溫138克隆所得WJ-4CL基因和硬殼完整品種紙皮克隆所得ZJ-4CL基因序列一致性為74.76%。經過Blast在線比對，發現WJ-4CL及ZJ-4CL基因與其他植物的4CL基因具有較高的相似性，選取與WJ-4CL及ZJ-4CL相似性較高的19種植物構建核桃4CL基因的系統進化樹(圖5)。結果顯示，核桃與喬木類植物親緣關系較近，白樺、歐洲白樺與光皮樺等樺樹較好的聚為一支，野草莓與覆盆子這2個薔薇目植物聚為同一支，薔薇科梨屬的沙梨與蕓香科花椒屬花楸樹聚為同一支，且自展值均為100，其他植物也各自與相近的植物聚為一支。硬殼完整核桃紙皮 (ZJ-4CL)與露仁核桃種質溫138 (WJ-4CL)聚為同一支，這說明就4CL基因而言，硬殼完整核桃紙皮與露仁種質溫138核桃的親緣關系較近，但具有較遠的遺傳距離，可能由于4CL基因在不同品種間的差異性所導致。

圖4 WJ-4CL及ZJ-4CL基因多重序列比對Fig.4 Multiple sequence alignment of WJ-4CL and ZJ-4CL gene

2.4 4CL蛋白二級結構分析

WJ-4CL、ZJ-4CL蛋白的氨基酸序列在線預測分析(圖6)。表明WJ-4CL蛋白含有32.34%的無規則卷曲和30.06%的α-螺旋，是WJ-4CL蛋白二級結構中最大量的結構元件，其次含有27.87%的延伸鏈和9.29%的β-轉角等結構元件。ZJ-4CL蛋白主要含有39.33%的α-螺旋，是ZJ-4CL蛋白二級結構中最為重要的結構元件，其次含有28.00%延伸鏈、22.00%的無規則卷曲結構及10.67%的β-轉角。

圖5 核桃與19種植物4CL基因系統進化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree of 4CL gene in walnut and 19 other plants

A.WJ-4CL蛋白二級結構; B.ZJ-4CL蛋白二級結構; h.α-螺旋; e.延伸鏈; t.β-轉角; c.無規則卷曲。A.Secondary structure of WJ-4CL protein; B.Secondary structure of ZJ-4CL protein; h.Alpha helix; e.Extended strand; t.Beta turn; c.Randon coil.

2.5 4CL蛋白三級結構預測

分別建立WJ-4CL與ZJ-4CL蛋白三維空間結構模型(圖7)。WJ-4CL與ZJ-4CL這2種蛋白質三級結構由α-螺旋、β-轉角、β-折疊和無規則卷曲構成，其中均以α-螺旋為主要結構元件，其他元件較少。蛋白三級結構分析可知WJ-4CL較ZJ-4CL結構復雜得多，其α-螺旋、β-轉角、β-折疊和無規則卷曲結構等元件含量較多。

A.WJ-4CL蛋白三級結構; B.ZJ-4CL蛋白三級結構。A.The tertiary structure of WJ-4CL protein; B.The tertiary structure of ZJ-4CL protein.

2.6 WJ-4CL、ZJ-4CL基因相對定量分析

實時熒光定量PCR技術分析WJ-4CL、ZJ-4CL在核桃內果皮硬化過程中的表達水平(圖8)。WJ-4CL、ZJ-4CL基因相對表達量在核桃的8個不同發育時期中有非常明顯的差異，其中WJ-4CL基因相對表達量最高的花后100 d (117.78)是相對表達量最低的花后51 d (1.00)的117倍，ZJ-4CL基因相對表達量最高的花后86 d (205.07)是相對表達量最低的花后51 d (1.00)的205倍。由圖可以看出，溫138核桃內果皮硬化過程表達量呈現增長-降低-增長趨勢，相對表達整體呈現“N”型變化趨勢，其前期4CL基因表達量相對較小，至核桃內果皮硬化過程的后期其4CL基因大量表達；而紙皮核桃內果皮硬化過程表達量呈現增長-降低-增長-降低趨勢，相對表達整體呈現“M”型變化趨勢，花后86 d4CL基因表達量急劇下降。4CL基因在硬殼完整核桃內果皮中的表達量遠高于同期露仁核桃內果皮中的表達量。

A.WJ-4CL基因相對表達量; B.ZJ-4CL基因相對表達量;06-07.花后51 d;06-13.花后57 d; 06-21.花后65 d; 06-28.花后72 d; 07-04.花后78 d; 07-12.花后86 d; 07-20.花后94 d; 07-26.花后100 d; 不同小寫字母表示不同時期之間的顯著性差異(P<0.05)。

A. Relative expression ofWJ-4CLgene; B.Relative expression ofZJ-4CLgene; 06-07.51 d after anthesis; 06-13.57 d after anthesis; 06-21.65 d after anthesis; 06-28.72 d after anthesis; 07-04.78 d after anthesis; 07-12.86 d after anthesis; 07-20.94 d after anthesis; 07-26.100 d after anthesis; Different lowercase letters indicate significant differences between different periods (P<0.05).

圖8 核桃內果皮硬化過程4CL基因相對表達水平
Fig.8 Relative expression level of4CLgene during hardening of walnut endocarp

3 結論與討論

本試驗克隆得到露仁核桃種質溫138及硬殼發育完整核桃種質紙皮內果皮4CL基因，分別命名為WJ-4CL與ZJ-4CL，利用生物信息學預測獲得4CL基因的理化性質參數、二級結構、三級結構等，分析了4CL基因的進化關系及在核桃內果皮硬化過程中不同時期的相對表達特性。

WJ-4CL與ZJ-4CL基因均為AFD_class_Ⅰ蛋白超家族成員，根據試驗結果得知，WJ-4CL與ZJ-4CL推導氨基酸序列存在相同的非特異性位點(4CL)及功能結構域(cyc_hxne_CoA_lg、PLN02246、CaiC及AMP-binding)，這一結果與珊瑚菜(Glehnialittoralis)[18]、華南象草(Pennisetumpurpureumcv. Huanan)[19]相關研究結果吻合。同源性分析顯示，核桃露仁種質WJ-4CL基因與硬殼發育完整ZJ-4CL基因聚在一支，WJ-4CL、ZJ-4CL與喬木類植物親緣關系較近。WJ-4CL與ZJ-4CL核苷酸序列與光皮樺、白樺、歐洲白樺4CL基因及其氨基酸序列的相似性均達到83%以上，2個基因編碼的氨基酸序列與光皮樺、白樺、歐洲白樺4CL基因推導氨基酸序列相似性均在70%以上。發現不同植物間4CL基因也有較高的一致性，推測4CL在核桃發育過程中對內果皮(硬殼)完整程度有較大的影響。

本試驗實時熒光定量PCR結果顯示，溫138、紙皮核桃4CL基因在內果皮硬化的8個不同發育時期的相對表達量存在顯著差異，其中WJ-4CL前期的相對表達量均較低，在核桃硬核期的花后100 d達到最大值，是前期的117倍，相對表達整體呈現“N”型變化趨勢，對照紙皮核桃ZJ-4CL在花后86 d達到最大值，是前期的205倍，相對表達整體呈現“M”型變化趨勢，這與董麗麗等[20]的紅玉石籽石榴(Punicagranatumcv. Hongyushizi)研究有一定的差別，紅玉石籽木質素含量與4CL基因存在相關性，4CL基因的表達量呈現“∧”趨勢，前60 d木質素大量合成和積累(4CL基因表達量升高)，當木質素含量高到一定程度其合成開始減弱(4CL基因表達量開始下降)，說明4CL基因參與調控木質素合成。本研究與裴艷梅等[21]研究結果相吻合，在無核小棗(ZiziphusjujubaMill. Wuhexiaozao)4CL基因研究中發現，花期到花后50 d呈現先上升后下降的總趨勢，前期表達量很低，后期明顯上升。本試驗相對定量分析結果發現，4CL基因在硬殼完整核桃內果皮中的表達量遠高于同期露仁核桃內果皮中的表達量，說明露仁現象可能由于硬核期缺乏木質素的積累。由本試驗結果可以看出，在硬核期木質素的改變對核桃內果皮的發育存在一定的影響，核桃出現露仁現象與4CL活性的關系還有待進一步的研究。