屠宰豬豬肺炎支原體P36、P46、P97 R1、P146 氨基酸序列的差異分析

李潤成，方 超，卿任科，葛 猛，趙 墩，胡玉立，余興龍

(湖南農業大學 動物醫學院，湖南 長沙 410128)

豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，M.hyo)廣泛分布于世界各地，患豬主要表現為生長速度減慢，飼料轉化率低[1]，該病原致死率不高，但如果繼發感染可造成嚴重死亡，給養豬場帶來巨大經濟損失[2]。目前，用于預防豬肺炎支原體的疫苗主要是弱毒苗和滅活苗，疫苗免疫雖可提高豬群抵抗力，改善生產性能，但難以完全阻止該病原在豬群的傳播[3-5]。新型疫苗以及免疫評估方法的研究一直受到廣泛關注。其P36、P46、P97蛋白常作為基因工程疫苗或ELISA抗體檢測方法研究的重要目的蛋白[6-10]，另外，同樣作為豬肺炎支原體黏附因子的P146蛋白也開始受到關注[11]。對這些蛋白基因在當前流行菌株進化、變異情況進行調查和分析，對于生豬豬肺炎支原體疫苗研究、評估方法的開發均具有重要的意義，但至今，GenBank登錄的相關蛋白基因序列很少，不同蛋白分別只有8～17條左右的序列，且多數序列為2010年以前上傳。目前也沒有關于湖南省生豬豬肺炎支原體感染菌株遺傳變異情況的研究報道。因此，本研究選取了2014-2017年從湖南省長沙市屠宰場收集的不同時間、不同來源地的豬肺炎支原體陽性樣本，進行P36、P46、P97R1、P146基因測序，并結合GenBank登錄的菌株進行了氨基酸序列的比對分析，以便為該病原的防控研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

PCR金牌Mix購自北京擎科新業生物技術有限公司。

1.2 豬肺炎支原體陽性樣本DNA模板

于2014-2017年不同時間，從湖南省長沙市2個大型屠宰豬場收集了530個肺臟，用生理鹽水進行氣管灌洗，收集灌洗液、提取DNA進行豬肺炎支原體檢測后，保存。本試驗根據采樣時間和屠宰豬來源地挑選了17個不同時間收集，不同來源地的豬肺炎支原體陽性的DNA樣本作為研究對象。

1.3 豬肺炎支原體P36、P46、P97 R1、P146基因PCR擴增引物的設計與合成

根據GenBank登錄的相關基因序列(CP003131.1、AE017332.1、CP002274.1、AE017243.1、CP003802.1)，按照包含基因重要功能區、基因多變區和便于設計引物的原則，在P36基因的前后兩端50～100個堿基處設計引物，P46基因選在起始與終止區域附近的合適位置設計引物，P97則在使豬肺炎支原體具備黏附呼吸道纖毛功能所不可或缺的區域，R1區[12-13]前后設計引物，P146基因則根據GenBank登錄序列同源性比對情況，選在基因多變區的前后設計引物。具體引物信息見表1。引物送北京擎科新業生物技術有限公司進行合成。

1.4 不同基因片段的PCR擴增與測序

以選定的肺臟灌洗液DNA作為模板，采用高保真的金牌PCR Mix，按照表1中退火溫度進行不同基因的PCR擴增，具體操作按常規進行，PCR完畢后進行DNA 電泳鑒定，并將陽性PCR產物送北京擎科新業生物科技有限公司進行測序。

表1 豬肺炎支原體P36、P46、P97 R1、P146基因引物信息Tab.1 Primer used for P36,P46,P97 R1,P146 gene of M.hyo

注：63/55.前10個循環63 ℃；后20個循環55 ℃。

Note：63/55.The first 10 cycles at 63 ℃; The next 20 cycles at 55 ℃.

1.5 不同基因片段所編碼氨基酸序列的比對分析

根據PCR測序峰圖，將PCR測序結果進行處理后，利用Lasergene生物軟件翻譯成氨基酸序列，結合GenBank登錄的豬肺炎支原體菌株相應序列(疫苗相關菌株M.hyoJ株、168株、168-L株，及其他不同菌株序列)，采用Lasergene軟件進行同源性比較，并采用DNAStar生物軟件對不同蛋白差異明顯的功能區域進行抗原表位預測。考察屠宰豬肺臟樣本中菌株與GenBank登錄的菌株之間各蛋白氨基酸序列的遺傳變異情況。

2 結果與分析

2.1 P36、P46、P97 R1、P146基因PCR擴增結果

采用設計的引物，以挑選的豬肺炎支原體陽性DNA樣本為模板，進行PCR擴增，代表性結果圖片見圖1-4。由圖可見，各基因均擴增出了預期大小的特異性條帶。

M.DNA分子質量標準；1-5.PCR擴增產物；-.陰性對照。圖3同。M.DNA Marker;1-5.Product of PCR;-. Negative control.The same as Fig.3.

M.DNA分子質量標準；1-9.PCR擴增產物；-.陰性對照。M.DNA Marker;1-9. Product of PCR; -. Negative control.

圖3 P97 R1基因PCR擴增結果 Fig.3 PCR amplification of P97 gene R1 region

M.DNA分子量標準；1-7.PCR擴增產物；-.陰性對照。M.DNA Marker; 1-7. Product of PCR; -.Negative control.

表2 屠宰豬豬肺炎支原體基因序列GenBank登錄號Tab.2 Accession number of different gene of M.hyo from slaughter pigs

2.2 P36、P46、P97 R1、P146基因測序結果

將各基因PCR擴增陽性產物送公司進行測序，然后根據測序峰圖將序列進行編輯，結果表明，獲得P36基因為948 bp的完整序列；P46為5′端缺少114 bp(該區域在GenBank已登錄的13個序列中僅有2個序列出現1個核苷酸的差異，氨基酸序列無差異)、3′端缺少60 bp(該區域在GenBank已登錄的13個序列中一致性為100%)，共1 086 bp的基因片段；P97則為包含R1區在內的1 107 bp的部分基因片段；P146則為包含多變區在內的1 312 bp的基因片段。各序列GenBank登錄號見表2。

2.3 P36氨基酸序列比對分析結果

利用生物軟件Lasergene將測出的P36基因序列與GenBank登錄的，包括3個疫苗菌株在內的9個豬肺炎支原體P36基因進行演繹氨基酸序列比對分析，結果見圖5。由圖可見各菌株間P36蛋白氨基酸序列同源性均在99%以上。

2.4 P46氨基酸序列比對分析結果

利用生物軟件Lasergene將測出的P46基因序列與GenBank登錄的，包括3個疫苗菌株在內的13個豬肺炎支原體P46基因進行演繹氨基酸序列的比對分析，結果見圖6。由圖可見各菌株間P46蛋白氨基酸序列同源性較高，相互之間存在99%以上的一致性。

MG813441-MG813457.屠宰豬豬肺炎支原體菌株。MG813441-MG813457.Strains detected from bronchoalveolar lavage fluid of slaughter pigs.

MG813458-MG813474.屠宰豬豬肺炎支原體菌株。MG813458-MG813474.Strains detected from bronchoalveolar lavage fluid of slaughter pigs.

2.5 P97 R1區氨基酸序列比對分析結果

利用生物軟件Lasergene將測出的P97R1區基因演繹氨基酸序列與GenBank登錄的豬肺炎支原體氨基酸序列進行比對分析，同時統計各序列R1區重復氨基酸的類型及數量。結果見圖7、表3。R1區重復氨基酸序列數量在9以下的有3個Gen-Bank登錄的菌株(該3個菌株均為加拿大研究人員2003年上傳的菌株)；R1區包含9～11個重復氨基酸序列的菌株有3個疫苗相關菌株 168株(11個)、168-L(10個)、J株(9個)，4個檢測自屠宰豬肺臟的菌株，以及4個GenBank登錄的非疫苗菌株(1個2003年上傳序列，2個2005年上傳序列，1個2012年上傳序列)；包含14個以上重復氨基酸序列的菌株有11個來自屠宰豬樣本的菌株，5個GenBank登錄的序列。34個被比較的序列中，重復氨基酸序列在14個以上者占總數的47%。另外，從圖7和表3可見，包含疫苗菌株J株在內的只有9或9個以下重復氨基酸序列的4個菌株間，在重復氨基酸的類型(AAKPE/AAKPV/TTKPV/TAKPV/AVKPV/GAKPE)和數量之間只有2個菌株具有完全的一致性(AY512898、AY512903)。 通過DNAStar生物軟件將R1區進行抗原表位預測，結果發現包含不同類型、數量重復氨基酸序列的菌株之間存在明顯差異。尤其是存在16個以上重復序列組成的抗原表位與M.hyoJ 株相應區域的抗原表位明顯不同。

MG821209-MG821225.屠宰豬豬肺炎支原體菌株。表3同。MG821209-MG821225.Strains detected from bronchoalveolar lavage fluid of slaughter pigs.The same as Tab.3.

菌株或登錄號Strain or Accession NumberAAKPEAAKPVTTKPVTAKPV/AVKPV/GAKPE合計TotalAY512898、AY51290343108AY51290234018M.hyo J53109M.hyo 168-L550010CP003802511310AE017244370010MG821224451010MG821225、MG821223550010MG821214730111AY957500650011M.hyo 168650011AY380565550111MG821209651012AY512904660012U27294570012MG821217670013MG821216、821215、821210、821222、821221、821220770014U50901、AE017332770014MG821213、MG821211880016MG821219、MG821218961016AY512900、AY512895890017AY380564980017MG821212980018

2.6 P146多變區氨基酸序列比對分析結果

利用生物軟件Lasergene將樣本中測出的P146序列與GenBank登錄的豬肺炎支原體菌株進行P146氨基酸序列的比對分析。結果發現菌株間氨基酸序列差異主要集中在2個重復氨基酸序列區(P146 R1 PQ重復區、P146 R2 PS重復區)。2個重復區氨基酸序列同源性比較結果見圖8，J 株、168株、168-L和2個GenBank登錄序列(AE017244、DQ088147)、1個屠宰豬肺臟樣本(MH290015)在R1區出現較多的氨基酸缺失；168株、168-L株及3個GenBank登錄序列、6個屠宰豬肺臟樣本在R2區出現3～9個氨基酸的缺失。通過DNAStar生物軟件將P146多變區氨基酸序列進行抗原表位預測，結果發現R1、R2區氨基酸的缺失導致了相應區域抗原表位出現明顯的變化。

MH290001-MH290017.屠宰豬豬肺炎支原體菌株。MH290001-MH290017.Strains detected from bronchoalveolar lavage fluid of slaughter pigs.

3 結論與討論

豬肺炎支原體P36、P46基因比較保守[14-15]，這在本研究中也得到了相同的結果。P46是豬肺炎支原體膜表面蛋白,具有種特異性和很強的免疫原性，常作為新型疫苗研究或ELISA抗體檢測診斷抗原的研究靶蛋白[6,16]。P36蛋白是細胞胞漿蛋白,同樣具有強的免疫原性，但產生抗體的時間比較晚[14]，P97蛋白是主要參與豬肺炎支原體對豬呼吸道上皮纖毛細胞黏附的因子[12-13]。 P146蛋白是P97的同源類似物之一,同樣具有黏附纖毛的作用， Bogema等[11]通過免疫印跡檢測發現P146能被豬肺炎支原體疫苗免疫豬血清和康復豬血清識別，但目前尚沒有關于該蛋白的進一步研究。Feng 等[17]采用P97 R1、P46、P36 3個蛋白作為抗原，檢測豬肺炎支原體感染豬的免疫反應，證明針對P97R1的IgG出現相對更早、更明顯，且抗P97R1的sIgA濃度最高。此外，也有研究證明，用P97 C末端蛋白免疫生豬可產生特異性體液和細胞免疫反應，并可對豬肺炎支原體的攻毒具有較好的保護作用[8], Okamba等[9]用P97 C末端蛋白通過肌肉和滴鼻免疫小鼠，在血液和肺泡灌洗液均產生明顯的特異性抗體，并認為重組P97 C末端蛋白疫苗可能成為控制豬肺炎支原體感染的新策略。豬肺炎支原體在呼吸道是否能夠定殖主要取決于其吸附于生豬氣管纖毛的能力[18]，P97蛋白是主要參與豬肺炎支原體對豬呼吸道上皮纖毛細胞黏附的因子，其R1區中的重復氨基酸序列(AAPKE/V)為P97發揮纖毛黏附作用所必需的氨基酸序列，該重復序列在不同菌株間可出現變異并且該變異可影響病原對纖毛的黏附能力[12-13]。 一株豬肺炎支原體要具備纖毛黏附能力，其P97蛋白R1區至少應具備8個以上的重復氨基酸序列，并且至少要具備3個以上重復序列，該重復區才能被抗體識別[13]。豬肺炎支原體黏附生豬支氣管纖毛過程，主要是通過纖毛相應受體配位基與豬肺炎支原體P97、P146等黏附因子結合來實現[19]。針對P97蛋白的抗體能夠體外抑制豬肺炎支原體對宿主細胞的黏附[20-21]。P97重復氨基酸的增加或減少，將會導致蛋白發生改變，從而干擾免疫系統識別[22]并且支原體某些表面蛋白基因的變異可使其逃避動物抗體的攻擊[23]。此外，不同豬場流行菌株P97黏附因子R1區氨基酸重復數量可能存在差異，多數豬場可能有2個以上的菌株同時存在，且同一頭豬感染2個以上菌株后，肺臟病變更嚴重[24]。

豬肺炎支原體基因組A、T含量高，且存在較多重復序列，PCR擴增和測序均存在較大難度。本試驗首次對湖南生豬豬肺炎支原體感染菌株遺傳變異情況進行了初步調查以及重要蛋白氨基酸序列分析。17個樣本中有11個樣本豬肺炎支原體P97 R1區重復序列數量比GenBank登錄的3個疫苗相關菌株[25-28](J株、168株、168-L株)要多3～10個不等，但與豬肺炎支原體活疫苗菌株RM48株及Z株比較，17個樣本中豬肺炎支原體除有1株P97R1區比R48株、Z株(17個重復序列[28])多1個重復序列外，其他都低于17個重復序列。此外，樣本與M.hyoJ株、168株、168-L株之間P146均存在較大的差異，168株、168-L株在R1、R2重復區均存在氨基酸的缺失，J株在R1重復區存在氨基酸缺失，至于其他疫苗菌株，由于沒有相應基因序列上傳至GenBank，所以未進行比較分析。

已有研究表明，豬肺炎支原體滅活疫苗或活苗均可以誘導生豬產生系統和局部的免疫反應[10,29-30]，并且可誘導產生針對P36、P46、P97 R1區蛋白的抗體[10]。但當前豬肺炎支原體滅疫苗或活苗僅可減輕生豬感染豬肺炎支原體的臨床癥狀，改善健康水平，提高飼料轉化率，并不能完全阻止該病原的感染傳播[3-5,22]。是否與菌株間某一個或某一些蛋白的變異存在關系，尚沒有詳細的報道。鑒于P97、P146等蛋白的作用與特性，提示開展P97、P146等黏附因子的氨基酸序列篩選和研究或許能進一步通過疫苗阻止豬肺炎支原體對氣管纖毛的黏附，從而進一步提高疫苗的免疫效果。本研究進一步豐富了豬豬肺炎支原體4個重要功能蛋白的序列資料，首次對湖南省生豬豬肺炎支原體感染菌株遺傳變異情況進行了初步調查。