MYL3基因在肉牛肌肉生長過程中的功能研究

劉瑞莉，吳 磊，袁 瑋，柏學進,3，呂娟娟,3，董雅娟,3

(1.青島農業大學，山東 青島 266109；2.山東省黑牛繁育工程技術研究中心，山東 青島 266109；3.山東布萊凱特黑?？萍脊煞萦邢薰?，山東 淄博 256306)

肌漿球蛋白(Myosin)是骨骼肌中重要的結構蛋白和收縮蛋白，最早由Kuehne發現并命名，其中肌球蛋白輕鏈3(Myosin light chain 3,MLC1v或MYL3)編碼199個氨基酸，位于牛的22號染色體[1]。早期研究發現，MYL3結合Ca2+能夠促進肌肉發育，并參與橫紋肌的收縮過程[2]，進一步研究發現，MYL3參與肌肉力量發育和神經調節肌肉收縮的相關過程[3]。Meder等[4]研究斑馬魚時發現MYL3的C-末端絲氨酸殘基的磷酸化對心臟收縮具有重要意義。近期，人們對MYL3蛋白及其表達的研究主要集中在心肌組織中，發現MYL3主要在哺乳動物的心肌細胞中表達，其突變與心肌肥大有關[5-6]，臨床中已將MYL3的突變確定為家族性肥厚型心肌病的病因，并與左心室肥大有關，迄今已確定MYL3中有5個突變：M149V、R154H、E56G、A57G和E143K，均聚集在EF-hand結合區域周圍，表明該區域的正確構象對于維持正常的心臟功能是必不可少的[7]。最新研究發現，當人類衛星細胞在缺氧環境中培養時，MYL3基因表達量增加，促進其分化成成肌細胞[8]。因此，推測MYL3基因可能是調節骨骼肌發育的候選基因。

布萊凱特黑牛是青島農業大學科研成果轉化基地及教學實習基地即山東布萊凱特科技股份有限公司培育而成的優良肉牛新種質，2015年我國肉牛權威專家將其鑒定為新種群[9]。魯西黃牛是一個役肉兼優的地方良種，海外譽為山東膘牛[10]。本試驗擬通過對生長性能不同的布萊凱特黑牛和魯西黃牛的背最長肌和骨骼肌基因進行結構特征分析和功能表達驗證，為后續研究肉牛MYL3基因的生物學功能及其表達奠定理論基礎，進一步為肉牛肉質性狀的分子選育提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗動物選自青島農業大學科研成果轉化基地及教學實習基地即山東布萊凱特黑?？萍脊煞萦邢薰?。選擇飼養條件一致、體況相近、健康的黑牛和黃牛各12頭，分別采集黑牛和黃牛2(平均體質量分別為66 kg/54 kg，下同)，6(214 kg/198 kg)，10(273 kg/264 kg)，12月齡(307 kg/291 kg)背最長肌，每個時間點各3頭，完成采集后立即放入液氮保存；黑牛宰殺后迅速采集甲狀腺、胰腺、腎上腺等組織各2～5 g，立即放入液氮保存。

1.2 主要試劑

TRNzolTrans、DNA MarkerⅡTransSCript ONE STEP gDNA Removal and cDNA SynthesisSuperMix均購自天根生化科技(北京)有限公司；iTaqUniwersal SYBR Green Supermix購自青島溯源生物有限公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(2×)、轉印濾紙、TMB顯色液均購于上海碧云天生物技術有限公司；抗體：Rabbit Anti-MYL3 antibody、Anti-beta Actin antibody；Anti-Rabbit IgG-FITC、Anti-Rabbit IgG購自北京博奧森生物技術有限公司和美國Sigma公司[11]。

1.3 RNA的提取及cDNA的合成

用TRIzol法從各組織中提取RNA，用全式金反轉錄試劑盒將提取的RNA反轉錄為cDNA，具體操作步驟參考文獻[11]。

1.4 MYL3基因的克隆與測序及生物信息學分析

根據肉牛MYL3基因(GenBank登錄號：NM_001076501.2)序列和GAPDH基因(GenBank登錄號：NM_001034034.2)的序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計引物，引物信息見表1，引物由青島擎科梓熙生物技術有限公司合成。以上述獲得的cDNA為模板進行RT-PCR，對PCR擴增產物進行膠回收，通過T載體連接試劑盒將目的基因連接到pMD19-T載體上，反應體系見表2，具體步驟參照pGM-T克隆試劑盒[11]；轉化至DH5α感受態細胞，搖菌，培養12 h后，PCR 檢測獲得陽性克隆產物，送至上海生工生物有限公司進行測序。

表1 引物信息Tab.1 The primers information

表2 連接反應體系Tab.2 Reaction system of the connection

利用DNAMAN軟件進行基因序列比對[11]；采用MEGA 軟件構建系統進化樹；利用DNAStar中的Protean程序對MYL3蛋白的二級結構進行分析預測；高級結構預測通過在線網站(http://www.expasy.org/seissmod/swiss-mod-el.html)完成。

1.5 MYL3基因的表達分析與統計分析

反應體系(20 μL)：iTaqUniwersal SYBR Green Supermix 10 μL，RNA-free Water 8 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板cDNA 1 μL。反應程序：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，40個循環[11]。統計分析：采用2-ΔΔCT值法計算各樣本中MYL3相對內參基因GAPDH的表達量，利用SPSS 17.0軟件t檢驗對數據進行差異顯著性分析，結果以平均值±標準差的形式表示[11]。

1.6 熒光免疫組化

組織切片脫蠟、至水后，進行抗原修復，自然冷卻至室溫；PBS緩沖液清洗3次，8 min/次；滴加山羊血清進行封閉，室溫放置30 min；取出玻片，滴加一抗(兔抗山羊MYL3)1∶150，覆蓋組織片，置于4 ℃冰箱過夜。PBS緩沖液洗3次，10 min/次，滴加二抗，覆蓋組織片，置于37 ℃恒溫箱中30 min。PBS緩沖液洗3次，10 min/次；滴加DAPI染色，室溫放置5 min；利用抗熒光衰減劑封片，避光保存，熒光顯微鏡觀察并拍照分析[11]。

1.7 總蛋白質的提取及免疫印跡檢測

將肌肉組織樣品置于預冷的研缽中，用液氮充分研磨，保持低溫，將粉末轉移到含有1.5 mL RIPA裂解液的離心管中，充分混勻置于冰上30 min，每隔10 min劇烈振蕩30 s，加入5× SDS 5 μL，懸浮振蕩20 s，3 500 r/min離心1 min。沸水處理5 min，12 000 r/min離心5 min，取上清即肌肉組織總蛋白質。將總蛋白質用SDS-PAGE濃縮分離后轉移到PVDF膜上進行蛋白免疫印跡分析，加入抗體稀釋比例一抗：Myl3(1∶500)、β-actin(1∶1 000)；二抗辣根過氧化物標記山羊抗兔IgG(H+L)(1∶2 000)，具體步驟參考文獻[12]。使用發光試劑盒，在暗室曝光顯影。然后掃描底片，利用Image J 1.39U對目的條帶進行光密度值分析。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR分析

以布萊凱特黑牛的cDNA 為模板，通過RT-PCR 克隆到一條大約645 bp的條帶，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1，目的條帶單一無拖尾，明亮清晰。經測序得到MYL3基因，長度為645 bp，與預期相符，可用于后續試驗。

2.2 MYL3生物學信息分析

生物學分析結果表明，MYL3基因CDS序列全長600 bp，編碼199個氨基酸；對獲得的布萊凱特黑牛MYL3基因CDS序列與牛、瘤牛、野豬、山羊、綿羊、家犬、人、黑猩猩、家鼠和原雞GenBank中MYL3基因CDS序列進行同源性比較，結果發現(表3)，除家犬(73.65%)和原雞(71.31%)外，布萊凱特黑牛與其他脊椎動物的同源性均大于80%；采用 UPGMA 法對各物種進行聚類分析(圖2)，結果顯示，布萊凱特黑牛與牛、瘤牛相距最近，其次與山羊、綿羊相距較近；原雞與上述動物相距最遠。

圖1 MYL3基因全長cDNA擴增結果Fig.1 Full length cDNA amplification of MYL3

圖2 MYL3 cDNA序列構建的系統發生樹Fig.2 Constructed of phylogenetic tree according

2.3 MYL3基因編碼蛋白的特征分析

本研究預測分析了布萊凱特黑牛MYL3蛋白的基本性質(表4)，結果發現，該蛋白質的分子式為C969H1529N253O302S11，編碼199個氨基酸，其等電點小于5，說明是偏酸性蛋白質；在構成該蛋白質的20種氨基酸中，谷氨酸Glu含量最高(11.6%)，其次是丙氨酸(Ala)和賴氨酸(Lys)(均為10.1%)；不穩定系數和脂溶性指數說明該蛋白質的流動性大；總平均親水性為-0.606，即水溶性蛋白質。MYL3蛋白的二級結構預測(圖3)結果顯示，MYL3蛋白以α-螺旋(40%)和無規卷曲(30%)為主，含有少量的β-折疊和β-轉角，其中α-螺旋的比例最高；對MYL3蛋白的三級結構進行在線預測，結果如圖4所示。

表3 布萊凱特黑牛肌球蛋白輕鏈cDNA序列與其他物種同源性比對Tab.3 Homology comparison of MYLs cDNA between Black cattle and other species %

表4 MYL3蛋白的基本性質Tab.4 Physiochemical characters of MYL3 protein

圖3 MYL3 蛋白二級結構Fig.3 Predicted secondary structure of MYL3 protein

圖4 MYL3蛋白的三級結構Fig.4 Predicted tertiary structure of MYL3 protein

2.4 MYL3基因的表達分析

以布萊凱特黑牛為研究對象，選擇管家基因GAPDH作為內參對照，分別對10個組織提取的總RNA進行實時熒光定量PCR表達譜分析。由圖5可知，MYL3主要在心臟中表達且表達量最高(P<0.01)；其次在背最長肌中表達(P<0.01)；在肝臟、脾臟等其他組織中幾乎不表達，彼此之間差異不顯著(P>0.05)。研究MYL3基因在不同時期的表達規律發現(圖6)，MYL3在4個不同時期隨著供試牛月齡的增加基因的表達量逐漸增加，其中魯西黃牛12月齡的表達量最高，其次是10月齡，基因的表達量均極顯著高于6月齡和2月齡2個時期(P<0.01)；6月齡和2月齡MYL3的表達量逐漸降低且差異不顯著(P>0.05)。布萊凱特黑牛12月齡的表達量最高且極顯著高于其他3個時期(P<0.01)；2，6，10月齡表達量逐漸增加且差異不顯著(P>0.05)。同一時期不同品種間MYL3基因的表達量進行比較發現，布萊凱特黑牛均高于魯西黃牛，其中2，12月齡差異顯著(P<0.05)，6，10月齡差異不顯著(P>0.05)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；相同字母或無字母標注表示差異不顯著(P>0.05)。

Values with different small letter mean significant difference(P<0.05);And with different capital letter mean extreme differences(P<0.01);While with the same or no letter mean no significant difference (P>0.05).

圖5MYL3不同組織表達水平
Fig.5 The expression level ofMYL3gene in different organization

2.5 熒光免疫組化

如圖7，MYL3免疫反應物質為綠色[13]，細胞核呈現淡藍色或藍色，在本試驗肌肉組織中，MYL3蛋白主要在肌原纖維的粗肌絲中表達，縱切呈條紋狀，橫切呈邊緣狀，由此揭示MYL3蛋白可能對肌原纖維起作用，進而對肌肉生長產生影響。

同一肉牛不同月齡間的差異用字母表示。N表示相同月齡不同肉牛間差異極顯著(P<0.01)；n表示相同月齡不同肉牛間差異顯著(P<0.05)，無字母標注表示差異不顯著(P>0.05)。H和B分別代表魯西黃牛和布萊凱特黑牛。圖8同。

The difference between the different ages of the same cattle is indicated by letters. N indicates extreme differences(P<0.01)between different cattle at the same age;n indicates significant difference(P<0.05),no letter mean no significant difference (P>0.05).H and B, respectively, on behalf of the Luxi cattle and Black cattle. The same as Fig.8.

圖6MYL3基因不同時期的表達水平
Fig.6 The expression level ofMYL3gene in different periods

圖7 魯西黃牛(A，B)和布萊凱特黑牛(C，D)背最長肌中MYL3蛋白的表達特征Fig.7 Expression of MYL3 protein in the longissimus dorsi muscle of Luxi cattle(A,B) and Black cattle(C,D)

A.不同時期MYL3蛋白的表達量，以β-actin作為內參； B.灰度分析。A.The expression of MYL3 protein in different periods was determined by β-actin as an internal reference; B.Grayscale analysis.

2.6 蛋白免疫印跡

為了進一步研究MYL3基因在蛋白質水平的表達，本試驗運用Western Blotting試驗驗證目的蛋白的表達，得到2條大小約為21 ku的目的蛋白條帶：圖8-A中MYL3(B)、(H)；得到2條大小約為42 ku的內參蛋白條帶：圖8-A中β-actin(B)、(H)。結果表明，MYL3蛋白抗體具有良好特異性，且該蛋白在肌肉組織的各時期均有表達，但表達量不同。進一步對蛋白免疫印跡結果進行灰度分析(圖8-B)，結果發現，12月齡MYL3蛋白表達量最高，極顯著高于其他3個時期(P<0.01)；其次是10月齡和6月齡；2月齡MYL3蛋白的表達量最低，差異不顯著(P>0.05)，MYL3蛋白的表達量隨著供試牛月齡增加逐漸增加。4個時期黑牛肌肉組織中MYL3蛋白表達量除10月齡，其余3個時期表達量均高于魯西黃牛，其中2，12月齡表達量差異顯著(P<0.05)，6，10月齡差異不顯著(P>0.05)。

3 結論與討論

3.1 肌球蛋白輕鏈3基因克隆與分析

本研究利用普通PCR法克隆了布萊凱特黑牛的MYL3基因序列，結果顯示，MYL3基因CDS序列全長為600 bp，編碼199個氨基酸。同源性分析顯示，MYL3序列具有較高的同源性，其中布萊凱特黑牛MYL3序列與牛、瘤牛、野豬、山羊、綿羊、人均大于80%，說明該基因CDS序列在脊椎動物中具有高度保守性，與“重要功能蛋白氨基酸置換率較低”理論相一致[14]。生物學信息分析顯示，MYL3蛋白分子式為C969H1529N253O302S11，等電點小于5，屬于偏酸性蛋白質；不穩定系數大于40，蛋白質結構穩定性較差；蛋白質的總平均親水性為-0.606，非極性氨基酸含量較高，表現親水性；二級結構發現，α-螺旋和無規卷曲為主要結構元件，含有少量的β-折疊和β-轉角，易于形成球狀蛋白，屬于all-alpha型，蛋白質的水溶性較好，這與上述預測的蛋白質基本性質中的總平均親水性相一致。這些特征與其他物種MYL3序列的特征結構均相似[15]。MYL3蛋白三級結構均由一條多肽鏈構成，結構呈桶狀，屬于球狀蛋白，說明該基因編碼蛋白質保守性較強，符合“多基因家族的協同進化”理論[16]，與上述同源性比對中揭示的物種進化關系相一致。

3.2 MYL3基因相對定量表達分析

早期研究發現，肌球蛋白輕鏈3基因僅在快肌中表達，含有α(MYH6)和β(MYH7)2個不同的亞型，2種亞型的差異表達可以最大限度地調節肌肉的收縮功能[2]。Sherwood等[17]研究發現，MYL3C-末端絲氨酸殘基的磷酸化對心臟收縮具有重要意義，綜上認為MYL3可能參與肌肉發育和神經調節肌肉收縮的相關過程。本試驗研究MYL3基因在不同組織的表達規律時結果發現，MYL3主要在心臟中表達，其次在背最長肌中表達，肝臟、脾臟等其他組織中則幾乎不表達，這與在羊上的研究結果一致[8]。Komurcu-Bayrak等[7]使用Northern印跡法研究發現，成年小鼠的MYL3主要在心肌表達，其表達量高于骨骼肌，而在其他組織中則幾乎不表達，這與本試驗結果相一致。綜上研究表明，MYL3基因在骨骼肌中表達水平僅次于心肌，由此推測MYL3可能在肌肉生長發育和肌肉收縮過程中發揮重要的作用。

Koning等[8]研究發現，在低氧環境人的骨骼肌衛星細胞分化時，MYL3基因表達量上調會促進肌源性干細胞轉化形成成肌細胞。本試驗研究發現，2種肉牛MYL3在4個不同時期肌肉組織中其表達量隨著月齡的增加逐漸增加，這與豬上的研究結果一致[18]。MYL3表達量結合肉牛體質量增長曲線發現，MYL3表達量隨著月齡增加的同時，肉牛體質量也在增長，顧志良等[19]研究發現，肌球蛋白輕鏈1(MYL1)在鵝胚胎期肌肉發育過程中起重要作用，MYL1包括MLC1f和MLC1v共2種異構體，在小鼠肌肉的發育階段，2種異構體的表達是相互獨立的，即在發育不同階段出現，MLC1f是從胚胎骨骼肌的分化時期開始積累，MLC1v從胚胎骨骼肌發育時期開始大量積累[2]。依上述研究結果推測，MYL3基因在骨骼肌的生長發育過程中積累并發揮作用，推測其能夠促進骨骼肌的生長發育。同時本試驗還發現4個時期黑牛和黃牛肌肉組織中MYL3基因的表達量存在差異，黑牛高于黃牛，這可能與肉牛的品種、個體的飼養環境以及機體的生長發育差異有關，具體關聯分析有待進一步研究。

3.3 MYL3蛋白表達分析

采用免疫組織化學的方法研究MYL3蛋白的表達定位，結果發現，MYL3蛋白主要在肌原纖維的粗肌絲中表達，謝遇春[20]研究發現， MYL3 蛋白可能定位于Ⅰ型即氧化性肌纖維上，Wolf Psort預測其亞細胞定位于細胞質的可能性最大，這與本試驗MYL3蛋白主要定位于細胞肌漿肌原纖維粗肌絲的結果一致[3]，同時可以印證“肌球蛋白具有ATP的結合位點，構成肌原纖維粗肌絲的主干”這一觀點[21]。本試驗魯西黃牛中MYL3蛋白表達的熒光的數量要多于布萊凱特黑牛，說明MYL3蛋白在粗肌絲中發揮作用，不同物種中其表達量不同。

為了進一步研究MYL3蛋白的表達水平，本試驗運用Western Blotting試驗獲得該蛋白質不同時期肌肉組織的相對表達量，結果發現，蛋白在肌肉組織的各時期均有表達且表達量不同?；叶确治霭l現，2種牛MYL3蛋白在4個不同時期表達趨勢相似，均隨月齡的增加逐漸增加，其中12月齡MYL3蛋白的表達量最高，極顯著高于其他3個時期(P<0.01)；2月齡MYL3蛋白的表達量最低，本研究與上述熒光定量mRNA的表達水平結果相一致，與MYL3表達可能對綿羊骨骼肌的生長沒有影響的結果相駁[21]，可能與試驗動物種類不同有關，但與豬上的研究結果一致[22]。Lee等[23]在雞中檢測到肌球蛋白基因在胚胎期持續表達，且在肌肉生長發育過程中不同階段表達的肌球蛋白亞型不同，表明MYL3蛋白在骨骼肌中發揮作用。本試驗中供試牛各生長發育時期MYL3蛋白的表達量差異顯著，結合肉牛體質量增長曲線分析顯示，肉牛體質量增加的同時MYL3蛋白的表達量也增加，Ling 等[24]鑒定了豬MYL1基因mRNA 5 個選擇性剪切體(MLC1f、MLC1v、MLC5f-A、MLC5f-B和MLC5f-C)發現，除了剪切體MLC1f外，其余剪切體基因的表達量均隨豬個體體質量的增加而逐步增加，到豬成年時其表達量迅速增至最高，與本試驗結果一致，因此，推測MYL3基因參與骨骼肌生長發育相關的調節，并在此過程中發揮促進作用。

克隆獲得黑牛MYL3基因CDS序列全長，編碼199個氨基酸，分析發現其與瘤牛、野豬、山羊親緣關近，同源性高；不同時期MYL3基因的表達量在肌肉組織中隨月齡的增加逐漸增加；MYL3蛋白主要在肌原纖維的粗肌絲中表達，不同生長發育時期蛋白質的表達量隨月齡的增加而增加，推測MYL3基因與肌肉生長發育密切相關，可能參與促進肌肉生長發育的相關調節過程。