調胃承氣湯對腸源性膿毒癥大鼠血液流變學指標和凝血功能的影響*

趙鋒利 趙 馥 張先進 徐運升 曹 蕊 林新峰 冼紹祥

（廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510405）

膿毒癥是在細菌、內毒素等有害物質侵入機體后引起機體產生全身炎癥反應綜合征（SIRS），導致多器官功能障礙，在ICU死亡率較高達25%的一種疾病［1］。膿毒癥發生時常伴有嚴重炎癥反應發生，后續會引起血液流變性異常與凝血功能障礙，進而引發彌散性血管內凝血（DIC），使微循環過程發生障礙。這一異常變化會引起組織缺血缺氧，從而加劇炎癥因子對于小腸等多種組織器官的破壞，形成多器官功能障礙綜合征（MODS）［2］。有研究證明調胃承氣湯具有一定的抗菌，增強免疫的功能，有改善腸道血液循環的作用［3］。本實驗研究意在應用符合臨床表征的膿毒癥模型，觀察調胃承氣湯通過對腸源性膿毒癥大鼠血液流變學指標和凝血功能的影響，并探討其改善腸黏膜屏障功能的機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠40只，體質量280～320 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK（粵）2013-0002，實驗動物質量合格證號No.44007200047550。動物實驗環境：廣東省中醫藥工程技術研究院SPF級動物實驗室，設施使用許可證號SYXK（粵）2010-0059。

1.2 試藥與儀器 調胃承氣湯高劑量組為9.45 g/kg，低劑量組為4.73g/kg。大黃（130908261）、芒硝（130707541）、甘草（130713191）均購自康美藥業股份有限公司。活化部分凝血活酶時間（APTT）測定試劑盒（凝固法，生產批號 173211012）；凝血酶原時間（PT）測定試劑盒（凝固法，生產批號 176209011）；凝血酶時間（TT）測定試劑盒（凝固法，生產批號172911011）。以上試劑均購自北京普利生儀器有限公司。大鼠腫瘤壞死因子-α酶聯免疫檢測試劑盒（TNF-α），生產批號 569180115；大鼠D-乳酸酶聯免疫檢測試劑盒 （D-LA），生產批號254180115。以上試劑盒均購自天津安諾瑞康生物技術有限公司。鋨酸晶體、Epon812純樹脂與檸檬酸鉛，均購自美國TED PELLA公司；醋酸雙氧鈾，購自美國SPI公司。C2000-A高性能血凝儀（北京普利生儀器有限公司）。Hemsr全自動血流變檢測儀（LBY-N7500A，中國）；L-600臺式大容量低速離心機 （上海利鑫堅離心機有限公司）；Varioskan Flash型全波長多功能酶標儀，美國Thermo公司；UC-7超薄切片機，德國萊卡公司；JEM-1400 PLUS日本電子透射電子顯微鏡，日本JEOL公司。

1.3 模型制備 根據臨床表現，采用表征與之最為相似的盲腸結扎穿刺法（CLP）建立腸源性膿毒癥大鼠模型［4］。造模前大鼠禁食12 h，不禁水，用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射以麻醉大鼠。大鼠處于麻醉狀態后備皮，采用無菌手術刀沿腹中線盲腸區域開口約1～2 cm，小心取出盲腸并置于消毒紗布上，用消毒棉簽將部分糞便推至盲腸尾端。采用1號醫用真絲編織線結扎盲腸中段，注射1 mL 0.9%氯化鈉注射液稀釋糞便以便流出，用10 ml注射器針頭將盲腸穿3次孔，糞便能順利慢慢流出即可，將盲腸放回腹腔。逐層縫合后腹腔注入5 mL 37℃0.9%氯化鈉注射液進行生理復蘇大鼠。歸籠，自由飲食飲水。

1.4 分組與給藥 采用隨機數字表法將40只雄性SD大鼠隨機分為5組，每組8只。具體組別與給藥方案見表1。給藥時間為模型建立成功后2 h、10 h與24 h。

表1 大鼠組別與給藥方案

1.5 標本采集與檢測 24 h給藥完成0.5 h后用10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈采血，3 mL枸櫞酸抗凝血，4 mL非抗凝血，血液3 000 r/min離心10 min后取血清。取約1 mm3小腸組織塊置于預冷2.5%中性戊二醛固定液中，前固定2 h或以上。以備電鏡檢查。1）血液系統相關指標檢測。運用Hemsr全自動血流變檢測儀檢測各組大鼠全血黏度（低切、中切與高切）、紅細胞聚集指數和血漿黏度；運用C2000-A高性能血凝儀檢測各組大鼠血清中APTT、PT和TT。嚴格按照酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒檢測血清中TNF-α和D-LA含量。2）腸黏膜組織超微結構觀察。取2.5%戊二醛固定標本，用0.1 mmol/L磷酸緩沖液漂洗6次，每次30 min。1%鋨酸固定1.5～2 h。用0.1 mmol/L磷酸緩沖液漂洗3次，每次10 min。酒精梯度脫水，樹脂浸透，包埋，固化，切8 nm超薄片，鈾鉛雙染色，透射電鏡下觀察。

1.6 統計學處理 應用SPSS22.0統計軟件。首先進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，服從正態分布以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時用LSD法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠血液流變學指標比較 見表2，圖1。與假手術組相比，GOS模型組大鼠全血黏度（低切、中切與高切）、紅細胞聚集指數與血漿黏度顯著升高 （P＜0.01）。與GOS模型組相比，烏司他丁組、TWCQT高劑量與低劑量組大鼠全血黏度（低切、中切與高切）、紅細胞聚集指數與血漿黏度顯著降低（P＜0.01）。

表2 各組大鼠血液流變學指標比較（x±s）

表2 各組大鼠血液流變學指標比較（x±s）

與假手術組比較，**P＜0.01；與 GOS 模型組比較，△△P＜0.01。 下同

全血黏度（mPa·s）組 別 n低切 中切 高切17.7±1.00 7.91±0.59 5.66±0.43 2.61±0.25 1.18±0.02血漿黏度（mPa·s）紅細胞聚集指數假手術組 8 GOS模型組 8烏司他丁組 8 25.20±2.94**12.45±1.53** 8.10±0.82**16.62±2.72△△ 7.73±1.08△△ 6.17±0.41△△3.54±0.39**1.36±0.03**2.69±0.35△△ 1.19±0.03△△TWCQT高劑量組 8 TWCQT低劑量組 8 19.58±0.98△△ 8.15±1.03△△ 6.49±0.48△△ 2.73±0.39△△ 1.19±0.02△△18.42±1.11△△ 8.13±0.57△△ 6.62±0.59△△ 2.70±0.50△△ 1.18±0.02△△

圖1 各組大鼠血液流變學指標變化

2.2 各組大鼠凝血功能的比較 見表3，圖2。與假手術組相比，GOS模型組大鼠血清中APTT、PT與TT顯著延長（P＜0.01）。與GOS模型組相比，烏司他丁組、TWCQT高劑量與低劑量組大鼠血清中APTT、PT與TT 明顯縮短（P＜0.01）。

2.3 各組大鼠血清中相關指標的比較 見表4，圖3。與假手術組相比，模型組血清中TNF-α和D-LA含量顯著升高（P＜0.01）。與GOS模型組相比，烏司他丁組、TWCQT高與低劑量組血清中TNF-α和D-LA含量顯著降低（P＜0.01）。

表3 各組大鼠凝血功能比較（s，x±s）

表3 各組大鼠凝血功能比較（s，x±s）

組 別 n TT假手術組 8 23.80±1.26 GOS模型組 8 33.92±3.20**烏司他丁組 8 25.20±3.43△△APTT PT 27.17±2.01 15.92±0.70 44.02±2.82**23.72±1.38**28.80±1.20△△ 17.51±1.08△△TWCQT高劑量組 8 27.89±2.49△△32.84±2.26△△ 18.75±1.11△△TWCQT 低劑量組 8 32.07±2.58△△17.40±1.13△△ 25.56±1.81△△

圖2 各組大鼠凝血功能的變化

表4 各組血清TNF-α和D-LA含量比較（s，x±s）

表4 各組血清TNF-α和D-LA含量比較（s，x±s）

組 別假手術組GOS模型組烏司他丁組TWCQT高劑量組TWCQT低劑量組n 8 8 8 TNF-α（pg/mL） D-LA（nmol/mL）85.63±8.93 0.18±0.02 125.69±9.10** 0.37±0.04**93.54±9.45△△ 0.23±0.04△△8 93.72±6.09△△ 0.26±0.05△△8 90.61±10.13△△ 0.25±0.03△△

圖3 各組大鼠血清TNF-α和D-LA含量的變化

2.4 各組大鼠腸黏膜結構電鏡觀察 見圖4。假手術組大鼠微絨毛結構完整且排列緊密，線粒體與內質網等細胞器無異常，緊密連接并無增寬；GOS模型組大鼠微絨毛嚴重斷裂脫落，線粒體嚴重腫脹且破裂，內質網變形，緊密連接擴張；烏司他丁組、TWCQT高劑量組與低劑量組大鼠較GOS模型組微絨毛無斷裂脫落，線粒體無嚴重腫脹，內質網破壞較少，緊密連接無明顯擴張，整體結構完整。

3 討 論

圖4 各組大鼠腸黏膜超微結構

膿毒癥初發期，細菌與內毒素感染迫使機體迅速啟動抗炎系統進行調控，大量炎癥因子釋放入血［5］。產生的炎癥因子直接損傷具有抗凝與抗黏附作用的血管內皮細胞，內皮細胞功能破壞后可引起出血導致DIC，伴隨血液流變學指標與凝血功能異常［6］。這種血液循環系統的障礙會延長炎癥因子在組織中的浸潤，產生持久性的器官損害作用［7］。一般腸黏膜組織最先受到炎癥因子的攻擊［8］，因此，血液流變學與凝血功能的障礙使得小腸黏膜組織屏障功能被炎癥因子破壞后，會引起其破壞作用的進一步加劇形成SIRS，導致多種器官的障礙，加劇膿毒癥的危害。

一旦炎癥因子激活凝血系統，抗凝血酶與凝血因子之間平衡打破。同時，纖溶系統被抑制，造成纖維蛋白溶解速度遠小于形成速度。二者將導致凝血功能的嚴重紊亂，且呈現出凝血系統激活后又促進炎癥因子作用的正反饋調節，加重炎癥反應的進行［9］。現代醫學研究中，通過對凝血功能指標APTT、PT與TT的測定，可判斷機體凝血功能的變化情況［10］。膿毒癥炎癥反應使血液黏度增加，導致血液循環阻力增大，血流速度減慢，血管內皮及其他組織細胞缺血缺氧，這種血液流變學指標異常會引起組織器官的損傷［11］。血液流變學指標中的紅細胞聚集指數反映紅細胞表面電荷大小，其值越大細胞越趨向于聚集，引起全血黏度增大。血漿黏度指標的變化也可反應凝血功能的變化，血漿黏度值越大表明其加速纖維蛋白原的“搭橋”的作用越強，從而加速凝血過程的能力越強［12］。因此，檢測血液流變學與凝血功能指標即可反映血液循環系統障礙變化，從而判斷其對機體炎癥反應的影響程度。

當細菌、內毒素進入血液循環系統引起感染時，體內促炎因子與抗炎因子的動態平衡狀態被打破，刺激巨噬細胞等分泌大量TNF-α等促炎因子，進而對組織器官產生損傷作用［13］。因此，血清中TNF-α可判斷機體炎癥反應嚴重程度；D-LA是胃腸道內大腸桿菌、乳酸菌、克雷白桿菌等多種固有細菌產生的代謝產物，哺乳動物正常組織無法產生D-LA，并且也無相應的乳酸脫氫酶將其代謝［14］。當腸黏膜屏障受損時，D-LA會通過受損黏膜進入血液循環，此時血中D-LA水平顯著增加。因此，檢測血中D-LA含量即可反映腸黏膜受損程度。

本研究結果顯示，調胃承氣湯能顯著抑制腸源性膿毒癥大鼠APTT、PT與TT的延長，抑制腸源性膿毒癥大鼠全血黏度、血漿黏度與紅細胞聚集數的增加，有效地改善膿毒癥的血液流變性與凝血功能障礙。血清中TNF-α的顯著降低也反映了調胃承氣湯對血液循環系統的改善作用，從而抑制了炎癥反應的加劇。腸黏膜超微結構與D-LA含量變化則顯示調胃承氣湯減少了炎癥因子對小腸黏膜組織的破壞，起到腸黏膜屏障功能的保護作用。

綜上，調胃承氣湯能有效地改善腸黏膜屏障功能，這種改善作用的機制可能是調胃承氣湯能通過對腸源性膿毒癥大鼠血液流變學指標和凝血功能的影響，減少炎癥因子對腸黏膜組織結構的破壞作用。