麝香通心滴丸對動脈粥樣硬化模型大鼠頸總動脈形態及hs-CRP的影響*

陳晶晶 賀 粵 趙東升 周亞濱 孫 靜 王淑榮△

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.江蘇省沭陽縣中醫院，江蘇 沭陽 223699；3.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 1500400；4.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150001）

冠心病穩定性心絞痛（SAP）發病率與死亡率在逐年上升［1］，防治冠心病刻不容緩。冠心病穩定型心絞痛的發生機制包括很多，其中炎癥機制占有主導地位，反應炎癥的指標有很多，例如纖維蛋白原和超敏C反應蛋白（hs-CRP）、血清脂蛋白相關磷脂酶A2（Lp-PLA2）。多年來結合文獻與臨床研究筆者發現導致胸痹心痛的“瘀”“熱”“毒”與炎癥因子導致冠心病的現代研究相一致。本實驗旨在觀察麝香通心滴丸對動脈粥樣硬化大鼠模型hs-CRP、Lp-PL-A2的影響，以及動脈粥樣硬化大鼠模型頸總動脈的形態學變化，探討麝香通心滴丸可能的作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 普通級別的SD大鼠80只，均為雄性，體質量180～200 g，大鼠于黑龍江中醫藥大學實驗動物中心購得，生產動物許可證：SYXK（黑）2016-004。大鼠在通風的及定期紫外線照射的環境下喂養，將大鼠分籠，室內物品嚴格消毒。室內溫度控制在（25±1）℃，相對濕度控制在50%～60%。普通飼料組成：碳水化合物60%、蛋白質22%和脂肪10%、其他8%。高脂飼料組成：普通飼料81%、豬油3%、黃15%和膽固醇1%。以上成分混合均勻再進行壓粒即可以作為實驗動物的飼料。

1.2 藥物與試劑 麝香通心滴丸（每丸重35 mg，批號140623），實驗前用研缽將藥品研成細末，用0.9%氯化鈉溶液配成所需濃度，藥液濃度為36.5%。瑞舒伐他汀鈣片（每片重5 mg，批號H20080240）。實驗前用研缽將藥品研成細末，用0.9%氯化鈉溶液配成所需濃度，藥液濃度為8.6%。垂體后葉素（1 mL/支×10支，出廠自南京新百藥業有限公司，生產批號H32026638），以上藥品都購買自黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院門診。Lp-PL-A2測定試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 實驗儀器 318W型洗板機，上海三科儀器有限公司；高速離心機，日本日立集團；電子秤，香山EK813股份有限公司；電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設備有限公司；冰箱，青島海爾股份有限公司。

1.4 造模與分組 60只大鼠參考文獻［2］，采用腹腔注射垂體后葉素制備模型。在1周的適應性喂養后，于尾靜脈處采血，檢測血脂水平有無異常。隨機取15只作為空白對照組，將剩余的45只大鼠進行造模每天喂養高脂飼料 （81%普通飼料，3%的豬油，1%膽固醇，15%蛋黃），喂養32 d后，連續3 d予腹腔注射垂體后葉素30 U/（kd·d）。在空白對照組中隨機抽取3只大鼠，在進行造模的45只大鼠中隨機抽取9只大鼠，用10%水合氯醛（3 mL/kg）進行腹腔內注射以麻醉，靜脈采血檢驗后發現血脂中的低密度脂蛋白與三酰甘油，均較空白對照組增加。取出的頸總動脈，在光鏡下顯示：不規則動脈管腔及內膜增厚，紊亂的平滑肌排列，彈力膜斷裂，泡沫細胞和脂質沉積在管周，細胞輕度炎性浸潤，提示造模成功。除去空白對照組及死亡的大鼠，造模成功的大鼠隨機分成3組，即模型對照組（n=10）、中藥治療組（n=10）、西藥對照組（n=10）。除空白對照組予普通飼料（碳水化合物60%、蛋白質22%、脂肪10%、其他8%）外，其余各組均予高脂飼料（81%普通飼料，3%的豬油，1%膽固醇，15%蛋黃）。

1.5 給藥方法 按標準體質量成人（70 kg）、標準體質量大鼠（200 g）及折算系數為0.018按照劑量公式進行劑量換算，具體用藥劑量如下，空白對照組：予西藥對照組及中藥治療組用藥同體積的蒸餾水10 mg/kg，每日1次灌胃。模型對照組：予西藥對照組及中藥治療組用藥同體積的蒸餾水10 mg/kg，每日1次灌胃。中藥治療組：麝香通心滴丸溶液 10.94 mg/（kg·d）灌胃。 西藥對照組：瑞舒伐他汀鈣片溶液 0.52 mg/（kg·d）灌胃。持續給藥8周，自由進食水。

1.6 標本采集與檢測 在第8周后，將各組SD大鼠禁食12 h后，予10%水合氯醛腹腔注射麻醉。用剪刀剃掉大鼠頸部的毛，常規消毒之后，沿頸總動脈到頸正中線旁3 mm處作1個平行切口（頸動脈切口位置：胸骨與下頜連線），沿著胸骨上7 mm處起，向上垂直延伸約15 mm處切開皮膚，充分暴露頸前肌群，在頸直肌和頸斜肌交叉處，可看見或明顯觸摸強烈搏動的頸總動脈，隨后剝離頸總動脈肌膜，從伴行呈白顏色的神經以及頸靜脈中游離出長度大約15 mm的頸總動脈，注意防止損傷神經，之后用線條將遠心端結扎，再將近心端動脈用血管鉗夾住，在頸總動脈兩端的中間插管取血，注意動脈釆血過程中，導管中要注入肝素鹽水，肝素濃度推薦為10～15 U/mL。1）取各組大鼠中動脈血，在離心機上以3 600 r/min速度，進行10min分離血清，再采用乳膠凝集比濁法，對hs-CRP進行測定。2）按試劑盒說明，采用雙抗體夾心法檢測標本中Lp-PL-A2水平。用純化的Lp-PL-A2抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入Lp-PLA2，再與HRP標記的Lp-PL-A2抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體的復合物，在徹底洗滌之后加入TMB顯色。HRP酶催化底物TMB使之變為藍色，與此同時酸將底物TMB變為黃色。顏色的深淺和標本中的大鼠Lp-PL-A2呈正比。用酶標儀在450 nm波長處讀吸光度（OD值），用標準曲線計算樣品中Lp-PL-A2濃度。3）剝離出頸總動脈，將上面殘血用0.9%氯化鈉注射液洗凈，再用10%的多聚甲醛溶液使標本牢固，用乙醇逐級脫水，覆蓋石蠟進行包埋切片，參照常規方法用HE進行染色來觀察頸總動脈內膜的情況。

1.7 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，組間采用t檢驗進行比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠hs-CRP、Lp-PL-A2水平比較 見表1。與模型對照組相比，空白對照組、中藥治療組、西藥對照組血清hs-CRP水平明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與西藥對照組相比，中藥治療組血清hs-CRP水平差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型對照組相比，空白對照組、中藥治療組、西藥對照組Lp-PLA2水平明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與西藥對照組相比，中藥治療組Lp-PL-A2水平差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠hs-CRP、Lp-PL-A2水平比較（x±s）

表1 各組大鼠hs-CRP、Lp-PL-A2水平比較（x±s）

與模型對照組治療后比較，△P＜0.05

組 別 n Lp-PL-A2（μg/L） hs-CRP（mg/L）空白對照組 10 6.19±2.56△ 1.76±0.45△模型對照組 10 12.60±4.74 4.30±0.86中藥治療組 10 7.11±2.83△ 2.80±0.73△西藥對照組 10 6.85±2.38△ 2.70±0.53△

2.2 各組大鼠頸總動脈病理形態觀察 見圖1。空白對照組大鼠頸總動脈結構完整，具有清楚的層次，有光滑、連續，的內膜，中層的平滑肌層分布均勻沒有萎縮，動脈管腔近圓形，有不規則增厚，彈力膜較清晰，局灶平滑肌排列紊亂，輕度腫脹；模型對照組的動脈血管壁內皮脫落，內膜有明顯的增厚，內皮下的間隙增寬，內彈力板斷裂，中膜平滑肌有明顯萎縮，管周有泡沫細胞和脂質沉積，炎細胞輕度浸潤；中藥治療組的內皮細胞有部分的脫落，結構較完整，只有少量的脂質沉積，并且內彈力板斷裂少見；西藥對照組主動脈壁結構鏡下顯示與麝香通心滴丸組相似。

圖1 對動脈粥樣硬化大鼠頸總動脈病理形態（HE染色，200倍）

3 討 論

3.1 麝香通心滴丸組方分析及現代藥理研究 麝香通心滴丸主要成分為人工麝香、人參、蟾酥、丹參、人工牛黃、熊膽粉和冰片［3］。方中麝香、蟾酥為君，活血止痛；人參莖葉總皂苷、丹參為臣，補氣活血，與麝香、蟾酥配伍以行氣血不暢之標，補心氣不足之本；佐以人工牛黃、熊膽清熱解毒、豁痰開竅；冰片為使，與麝香等配伍，增強清熱開竅止痛之功。總覽全方，補氣活血止痛，清熱化痰開竅，標本兼顧。本研究結果表明，麝香通心滴丸能夠減低動脈粥樣硬化大鼠hs-CRP及抑制Lp-PL-A2，同時保護心肌細胞不受損害，所以我們認為它的機制可能是因為麝香通心滴丸發揮活血清熱、化痰開竅的功效，活血化痰清熱，病邪乃去，則能治療動脈粥樣硬化。現代藥理研究顯示麝香可以抑制氧自由基和脂質過氧化，具有增強心肌收縮力，增大收縮幅度，改善內皮功能等作用，對心肌起到保護作用［4-5］。現代藥理研究表明人參能抑制心肌肥厚，增加血流量，營養心肌，人參皂苷能降低游離鈣離子，促進一氧化氮、環磷鳥苷的生成舒張血管［6-7］。蟾酥能保護心肌，降低心肌收縮力，其有效成分蟾酥靈能抑制鈣誘導鈣釋放［8］。丹參能保護內皮細胞，提高SOD活性，減少細胞凋亡，調節OX40/OX40L信號通路抗動脈粥樣硬化［9-10］。人工牛黃對心衰模型心臟有正性肌力作用，其主要成分牛磺酸可以抑制血小板凝集、血栓的生成保護心肌、抗心力衰竭［11-12］。熊膽粉能ECV304細胞的損傷，其有效成分熊去氧膽酸及牛磺鵝去氧膽酸能保護血管內皮細胞［13］。冰片能夠抑制炎性因子的表達，減輕炎癥反應，控制血栓的形成［14］。

3.2 麝香通心滴丸對hs-CRP及Lp-PL-A2表達的影響 hs-CRP是一種重要的微量蛋白質分子，它由肝臟合成、釋放，是判斷炎癥反應急性期的重要指標［15］。hs-CRP與病情輕重呈正相關，所以檢測hs-CRP對各種炎性疾病、機體受到創傷及心血管疾病有重要的價值［16］。Lp-PL-A2也是近年來備受熱議的炎癥標志物，它又稱為血小板活化因子乙酰水解酶，可催化脂蛋白和細胞膜上的甘油磷脂二位酰基酯鍵水解，最終形成非酯化脂肪酸及溶血磷脂［17］，這兩種物質均是促炎促凋亡的脂質調節物，介導炎癥細胞聚集至血管內皮細胞下，促使白細胞黏附因子等多種炎癥因子的表達，損傷動脈內膜，促進并參與動脈粥樣硬化的發生和發展［18］。本研究結果表明，麝香通心滴丸能明顯抑制動脈粥樣硬化大鼠心肌組織hs-CRP及Lp-PL-A2的表達，抑制炎性反應，治療動脈粥樣硬化，其與瑞舒伐他汀療效相當。

3.3 麝香通心滴丸對頸總動脈形態的影響 頸動脈因其解剖位置表淺，利于取材觀察，并且它病變的程度和冠狀動脈平行，已經成為臨床觀察外周動脈的首選指標［19］。頸動脈結構主要改變有二，一為頸動脈內膜中膜復合體厚度（IMT）增厚，二為斑塊形成，其常常作為最重要的評價動脈粥樣硬化嚴重程度的指標之一，冠心病患者頸動脈IMT及斑塊指數比健康人群明顯升高［20］，并且冠狀動脈病變程度越重，則頸動脈IMT及斑塊指數越高。本研究通過光鏡觀察頸總動脈形態，一方面為了判定動脈粥樣硬化模型復制是否成功，高脂飼料喂養32 d后，腹腔注射垂體后葉素3 d，采血測低密度脂蛋白、三酰甘油，在光鏡下頸總動脈顯示不規則動脈管腔及內膜增厚，泡沫細胞和脂質沉積在管周，細胞輕度炎性浸潤，認為本研究注射垂體后葉素的方法能成功復制動脈粥樣硬化模型。另一方面判定給藥8周后麝香通心滴丸組和瑞舒伐他汀組動脈粥樣硬化大鼠的療效，結果通心滴丸組、瑞舒伐他汀組大鼠頸總動脈脂質沉積及內彈力板斷裂明顯減少。

總之動脈粥樣硬化模型大鼠在進行麝香通心滴丸灌胃后hs-CRP與Lp-PL-A2降低，頸總動脈組織光鏡下的改變，可表明麝香通心滴丸可抑制炎性反應，延緩動脈粥樣硬化的進程，其療效與瑞舒伐他汀相當。