淫羊藿提取物對骨質疏松骨折大鼠愈合過程Notch信號通路的影響*

孫杰 宋鑫 王健

（上海市健康醫學院附屬浦東新區人民醫院，上海 201200）

骨質疏松是多種原因引起的一組骨病，使骨折的風險增加，絕經后的婦女尤其容易患骨質疏松癥，雌激素缺乏被認為是導致這種疾病的主要原因［1］。使用雌激素替代療法（ERT）對防止或延緩絕經后骨質疏松的發生具有較好的效果［2］。同時研究提示，使用ERT可以增加絕經后婦女患心血管疾病、卵巢癌和乳腺癌的風險［3-5］。因此，尋找預防和治療骨質疏松癥的替代方法值得探索。中國的草藥用于治療骨折和關節疾病已經有數千年的歷史。淫羊藿是治療骨質疏松癥最常用的草藥之一，具有“強腎”的功能［6］。中國的許多科學家先前的研究已經反復證明，淫羊藿提取物可以減少卵巢切除大鼠模型以及老化或其他大鼠模型中的骨質流失，但其作用機制還不清楚［7］。研究提示，Notch信號通路通過抑制成骨細胞分化，抑制骨原細胞分化，同時抑制原發性骨髓基質細胞的脂肪生成［8］。但淫羊藿提取物能否通過調控Notch信號通路來發揮治療骨質疏松的作用還不清楚。因此本研究通過制作大鼠骨質疏松骨折模型，探討淫羊藿提取物對骨質疏松骨折大鼠的治療效果及Notch信號通路發揮的作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇健康3月齡雌性SD大鼠25只，體質量220～240 g。SD大鼠由山東省醫學科學院實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（魯）2012-0002。動物合格證編號：2015000577866。在溫度為18～24℃、濕度為40%～70%、控制飼養環境晝夜循環（12 h/12 h）的SPF環境中自由進食和飲水，適應性喂養1周后進行實驗。

1.2 試藥與儀器 1）試藥：淫羊藿提取物購自石家莊以嶺藥業股份有限公司，棕色干粉，淫羊藿苷含量為54.56%，批號20161017。2）試劑：10%水合氯醛購自上海山浦化工有限公司；堿性磷酸酶（ALP）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；蛋白抽提試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；Notch1、骨保護素（OPG）、RANKL酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒購自上海恒遠生物科技有限公司。3）儀器：克氏針購自上海滬江醫療器材有限公司；Norland-XR36雙能X射線骨密度儀購自美國Norland-XR36公司；顯微CT購自比利時SkyScan公司；HBS-1096B酶標儀購自南京德鐵實驗設備有限公司；組織脫水機、包埋機、全自動輪轉切片機等病理配套設備購自德國Leica公司；高速冷凍離心機購自德國SORVALL Heraeus公司。

1.3 分組與造模 大鼠適應性喂養1周后進行實驗。根據隨機數字表法將大鼠分為正常骨折組10只和骨質疏松組15只。用10%水合氯醛（0.33 mL/100 g）麻醉后進行備皮消毒后，采用背部雙側去卵巢術切除雙側卵巢，正常骨折組只僅暴露腹腔，不切除卵巢，關閉傷口。術后給予20萬U青霉素肌肉注射，連續使用3 d。在溫度為18～24℃、濕度為40%～70%、控制飼養環境晝夜循環（12 h/12 h）的SPF環境中自由進食和飲水。術后3月，根據隨機數字表法從正常骨折組和骨質疏松組各選5只大鼠處死后檢測股骨骨密度確定骨質疏松模型制作成功。對所有大鼠制備右側股骨干中段橫行骨折模型［9］。將骨質疏松組分為骨質疏松骨折組和淫羊藿治療組。

1.4 干預方法 淫羊藿治療組灌胃給予濃度為110 mg/（kg·d）的淫羊藿提取物，正常骨折組和骨質疏松骨折組給予等量0.9%氯化鈉注射液，連續給予8周，心臟取血處死大鼠，取右側股骨，剔除軟組織后進行相關檢測。

1.5 觀察指標 1）骨密度測定：用Norland-XR36雙能X射線骨密度儀對大鼠右側股骨骨密度測量。采用小物體掃描模式：掃描速度為60 mm/s、掃描寬度5.0 cm、分辨率 1.0 mm×1.0 mm、準確度 0.01%。2）血清中ALP含量的測定：分離大鼠血清，根據堿性磷酸酶（ALP）試劑盒說明書（A059-2）進行ALP含量的測定。3）1.5 micro CT掃描：骨密度測定完成后，進行microCT掃描（掃描參數：電壓 80 kV、電流 80 μA、功率40 W、旋轉角度 360°、分辨率 21 μm、像素組合 1×1、幀平均數6）。用ZKKS-SHARP軟件進行分析，獲得相對骨體積（BV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨體積比（BV/TV）等股骨遠端參數。4）病理學檢測：取骨痂組織進行常規甲醛固定、脫鈣、脫水、包埋、切片（2.0 μm）、蘇木精-伊紅染色 （HE染色），觀察骨痂組織學特點。5）ELISA法檢測Notch1、OPG和RANKL蛋白表達水平：取骨折端骨組織，用液氮冷凍后進行研磨，將組織轉移到1.5 mL Eppendorf管中，加入1 mL磷酸鹽緩沖液后離心取上清，根據ELISA試劑盒說明書進行Notch1、OPG和RANK1蛋白含量測定。

1.6 統計學處理 應用IBM SPSS19.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，分析前進行正態性檢驗，采用單因素方差分析進行判斷，組間兩兩比較用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠骨密度和ALP水平比較 見表1。與正常骨折組比較，骨質疏松骨折組和淫羊藿治療組大鼠骨密度顯著降低，ALP含量增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與骨質疏松骨折組比較，淫羊藿治療組大鼠骨密度顯著增加，ALP含量降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠股骨遠端參數的比較 見表2，圖1。Micro-CT掃描可見，正常骨折組和淫羊藿治療組骨折部位對合良好，骨重塑規則勻稱，骨質疏松骨折組骨折端依然存在較明顯的間隙。與正常骨折組比較，骨質疏松骨折組BV、BV/TV和Tb.Th顯著降低，差異具有統計學意義 （P＜0.05），淫羊藿治療組BV、BV/TV和Tb.Th降低不顯著，差異無統計學意義（P>0.05）；與骨質疏松骨折組比較，淫羊藿治療組BV、BV/TV和Tb.Th顯著增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠骨密度和ALP水平比較（x±s）

表1 各組大鼠骨密度和ALP水平比較（x±s）

與正常骨折組比較，*P＜0.05；與骨質疏松骨折組比較，△P＜0.05。下同

組 別 n 骨密度（g/cm2） ALP（U/L）正常骨折組 5 0.19±0.02 73.54±4.19骨質疏松骨折組 5 0.15±0.01* 101.58±7.24*淫羊藿治療組 5 0.18±0.02*△ 85.10±8.43*△

表2 各組大鼠股骨遠端參數的比較（x±s）

表2 各組大鼠股骨遠端參數的比較（x±s）

組 別 n Tb.Th（μL）BV（mm3） BV/TV（%）正常骨折組 5 88.04±4.95骨質疏松骨折組 5 72.30±5.18*60.15±4.19 58.72±3.84 44.57±4.83*54.68±5.62*淫羊藿治療組 5 85.37±7.65△58.94±7.31△ 57.67±6.28△

圖1 大鼠右側脛骨骨折處冠狀位、矢狀位與橫截面Micro-CT掃描

2.3 各組大鼠骨痂HE組織學觀察結果 見圖2。正常骨折組可見成熟骨小梁形成，處于軟骨性骨痂向骨性骨痂轉換階段；骨質疏松性骨折組骨痂鄰近原骨小梁細小松散，向骨性骨痂轉化過程明顯延遲；淫羊藿治療組形態介于正常骨折組和骨質疏松性骨折組之間。

圖2各組大鼠骨痂組織學觀察結果（HE染色，100倍）

2.4 各組骨組織中Notch1、OPG和RANKL蛋白表達水平比較 見表3。與正常骨折組比較，骨質疏松骨折組和淫羊藿治療組Notch1和OPG顯著降低，RANKL顯著增高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與骨質疏松骨折組比較，淫羊藿治療組Notch1和OPG顯著增高，RANKL顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表3 各組骨組織中Notch1、OPG和RANKL蛋白表達水平比較（ng/g，x±s）

表3 各組骨組織中Notch1、OPG和RANKL蛋白表達水平比較（ng/g，x±s）

組別 n RANK1 Notch1 OPG正常骨折組 5 2.54±0.17骨質疏松骨折組 5 4.33±0.56 2.68±0.21 1.83±0.13 0.84±0.06* 0.90±0.05淫羊藿治療組 5 2.82±0.40 1.69±40.09 1.54±0.11

3 討 論

目前，抗骨質疏松藥物的研究主要在抑制骨吸收（雌激素、降鈣素、雷洛昔芬）和刺激骨形成（氟化物、合成代謝類固醇）［10］。其中，ERT是一種流行的預防和治療絕經后骨質疏松癥的方法，但潛在風險較高。植物雌激素具有與內源性雌激素相似的結構和生物活性，體外和動物研究的證據表明，植物雌激素不僅在與雌激素受體結合方面與雌激素競爭，而且具有弱雌激素或抗雌激素活性［11］。動物和人類研究表明，攝入植物雌激素可以降低乳腺癌的發病率［12］。淫羊藿廣泛用于骨病治療，黃酮類化合物是其主要的有效成分，可能通過雌激素受體發揮雌激素樣作用，對腫瘤細胞無增生性作用［13］。淫羊藿作為治療骨質疏松癥的替代療法在國際上未被廣泛接受，原因是對其作用機制和未知的活性成分缺乏明確的認識。本研究通過評價淫羊藿提取物對骨質疏松骨折大鼠愈合過程的作用發現，口服淫羊藿提取物8周后，可以減低血清ALP的活性，使骨密度增加，促進骨形成，這些骨保護作用與其他研究報道的ERT的骨保護作用相似。

本研究進一步證實了淫羊藿提取物對Notch信號通路的影響。Notch具有Notch1-4 4個受體，存在高度的結構同源性，其中Notch1可能是所有4個Notch受體的主要功能［14］。在體內和體外的成骨細胞中以及在骨再生過程中檢測到Notch1的表達，通過抑制破骨細胞的分化和成熟來增加其活性，促進骨礦物質沉積［15］。RANKL和OPG是骨吸收的關鍵調控因子，直接作用于破骨細胞。RANKL已被確認為一種關鍵的細胞因子，可調節破骨細胞生成和骨吸收［16］。成骨細胞產生的OPG對于巨噬細胞-破骨細胞譜系的細胞生存是必需的，OPG可以競爭性RANKL，使破骨細胞的生產減少，RANKL/OPG濃度比例決定了破骨細胞分化、成熟及功能，并最終影響骨密度、強度和重建［17-18］。本研究結果顯示，淫羊藿提取物能提高Notch1和OPG表達，降低RANKL表達。然而，在明確了淫羊藿提取物對骨質疏松治療效果后，為了使國際科學界對淫羊藿提取物作為骨病治療的替代方案認可，還需要更多的研究來確定淫羊藿提取物的活性成分以及在體內介導的作用機制。

綜上所述，淫羊藿提取物對骨質疏松骨折大鼠具有較好的治療作用，其機制可能與淫羊藿提取物能抑制ALP的活力、提高Notch1、OPG表達、抑制RANKL的表達、促進骨形成，提高骨密度有關。然而，為了淫羊藿提取物作為骨病治療的替代方案得到國際的認可，還需確定HEP提取物的活性成分及作用的機制。