靈芝烯酸B誘導Oct4去SUMO化激活G0期胃癌側群細胞*

成睿珍 ，張春艷 ，劉鳳婷 ，李 睿 ，吳文靜 ，李艷霞 ，馬曉芳 ，李麗麗 ，4，劉曉智

（1.天津市濱海新區中醫醫院藥學科，天津 300450；2.天津醫科大學臨床醫學院，天津 300070；3.天津市第五中心醫院中心實驗室，天津 300450；4.天津醫科大學腫瘤醫院骨與軟組織腫瘤科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心，天津 300060）

靈芝烯酸B（GAB）是一種從中草藥靈芝中提取分離得到的羊毛甾烷型三萜化合物[1]。研究表明，GAB對多種腫瘤細胞均具有較強的生長抑制作用，是一種頗具開發潛力的中藥有效成分[2]。但目前人類對其內在調控機制依舊知之甚少。本研究將以胃癌術后復發的根源——胃癌側群細胞為研究對象，選擇關鍵的干性維持蛋白八聚體結合轉錄因子4（Oct4）為靶點，從類泛素化修飾角度分析GAB對胃癌側群細胞的影響與潛在的分子機制，擬針對當前臨床胃癌患者對常規化療藥物順鉑耐藥性的問題展開研究，為未來基于GAB的中草藥研發和腫瘤治療方面的應用提供實驗參考。

1 材料

1.1 實驗細胞 人胃癌細胞株SGC-7901，購自美國ATCC公司。

1.2 試劑 GAB標準品（青島捷世康生物科技有限公司）、順鉑（山東齊魯制藥）；胎牛血清、達爾伯克改良伊格爾（DMEM）培養基、腫瘤干細胞專用培養基（美國 Gibco公司）；免疫磁珠（CD133+）細胞分選試劑盒（德國Miltenyi Biotec公司）；兔抗人CD133抗體（美國Chemicon公司）、小鼠抗人小泛素樣修飾蛋白（SUMO）-1抗體、兔抗人Oct4、Cyclin D1、Cyclin E1、Cyclin A2和 Cyclin B1抗體（美國Abcam公司）；四甲基噻唑藍（MTT）試劑盒（北京鼎國公司）。

1.3 儀器 二氧化碳培養箱（Thermo公司）、酶聯免疫分析儀（BioTek），流式細胞周期檢測由國家納米技術與工程研究院完成。

2 方法

2.1 胃癌側群細胞分離與培養 常規胰酶消化處于對數生長期的SGC-7901胃癌細胞，充分重懸至單細胞懸液，調整細胞終濃度為5×106個/mL，先后加入CD133抗體（終濃度為20 μg/mL）及二抗包被的超微磁珠，輕柔混勻后室溫孵育20 min，利用磁場及分離柱裝置分離得到CD133+和CD133-胃癌側群細胞。將CD133+胃癌側群細胞接種于96孔板中，使每孔僅含1個細胞，于含5%CO2、37℃的細胞培養箱中培養。

2.2 實驗分組與處理 取直徑接近100 μm的胃癌側群細胞克隆球，對其進行實驗分組：1）對照組：常規培養細胞96 h；2）GAB組：加入終濃度為10 μmol/L的GAB，持續作用96 h。每隔24 h于倒置顯微鏡下測量10個細胞克隆球直徑，繪制克隆球直徑變化曲線。

2.3 細胞周期檢測 取對照組及GAB組胃癌側群細胞分別經胰酶消化得單細胞懸液，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）漂洗后以70%乙醇4℃冰箱內固定過夜，碘化丙啶（PI）染色30 min，行流式細胞術檢測細胞周期分布情況，CELL Quest軟件采樣分析結果，以公式PIx=（S+G2M）/（G0G1+S+G2M）計算細胞增殖指數。

2.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）方法檢測蛋白表達 提取對照組及GAB組胃癌側群細胞總蛋白，以10%分離膠進行電泳，冰浴下110 V轉膜60 min，室溫下脫脂奶粉抗原封閉60 min，然后分別加入Oct4（1∶1000）、SUMO-1（1∶2000）、CyclinD1（1∶1000）、Cyclin E1（1∶2 000）、Cyclin A2（1∶5 000）和 Cyclin B1（1∶2 000）抗體，4℃水平搖床孵育過夜。次日使用二抗（1∶2 000）孵育60 min后用超信號蛋白檢測試劑盒檢測蛋白表達，凝膠成像系統掃描光密度值，QuantityOne軟件進行定量分析。以β-actin為內參。

2.5 MTT實驗 按上述實驗分組在細胞培養基中加入終濃度分別為 0.4、2、10、50 和 250 μg/mL 的順鉑，作用48 h后行MTT實驗，于酶聯免疫分析儀上分別測定其吸光度值（λ=490 nm），根據實驗結果繪制細胞生長曲線，計算順鉑對胃癌側群細胞的半數致死量IC50；設置空白對照組，3個平行孔。

2.6 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 克隆球生長曲線 自GAB藥物處理24 h開始后的4個不同檢測時間點，GAB組CD133+胃癌側群細胞克隆球直徑均明顯小于對照組，兩者間具有統計學差異（P＜0.05），見圖 1。

3.2 細胞周期分布情況 對照組CD133+胃癌側群細胞處于 G0/G1期的比例為（61.49±4.56）%，其細胞增殖指數 PIx=（38.51±5.06）%；GAB 組 CD133+胃癌側群細胞處于G0/G1期的比例為（43.54±4.09）%，其細胞增殖指數PIx=（56.46±3.87）%，與對照組相比，GAB組的細胞增殖指數具有明顯差異（P＜0.01），見圖 2。

圖1 CD133+胃癌側群細胞克隆球直徑生長曲線Fig.1 Clonal growth curve of CD133+gastric cancer side population cells in different groups

圖2 不同處理組CD133+胃癌側群細胞周期分布比較Fig.2 Cell cycle distribution of CD133+gastric cancer side population cells in different groups

3.3 Western Blot實驗檢測相關蛋白的表達情況 Western Blot結果顯示，與對照組比較，GAB組胃癌側群細胞的Oct4、SUMO-1和Cyclin D1蛋白表達水平顯著降低，而Cyclin E1、Cyclin A2和Cyclin B1蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），見圖3。

3.4GAB對胃癌側群細胞順鉑IC50的影響 對照組CD133+胃癌側群細胞對順鉑的IC50為29.65μg/mL，GAB組CD133+胃癌側群細胞對順鉑的 IC50為87.64 μg/mL，在順鉑濃度為 10 μg/mL 及 50 μg/mL作用下，兩組間IC50比較具有統計學差異（P＜0.05），見圖4。

4 討論

胃癌的癌變是個多因素、多步驟、多階段的發生、發展過程，涉及遺傳、環境、心理等多個方面[3]。腫瘤細胞中存在一群具有無限增殖潛能的類干細胞樣腫瘤細胞亞群，被稱為腫瘤側群細胞。這些細胞常處于休眠狀態，即細胞周期G0期，恰好能夠逃避當前以靶向細胞增殖周期S期及G2/M期的常規放、化療手段[4-5]。因此，理論上，靶向胃癌側群細胞的治療能夠起到事半功倍的效果。

圖3 Western Blot實驗檢測不同處理組蛋白表達結果Fig.3 Protein expression detected by Western Blot in different groups

圖4MTT實驗檢測GAB對不同組細胞增殖抑制率的比較Fig.4 Comparison with inhibition rates of cell proliferation in GAB groups by MTT assay

靈芝為中國傳統中藥，味甘性平，歸心、肝、肺腎經。具有補氣安神、止咳平喘、扶正固本之功效[6]。現代藥理學研究表明，靈芝及其有效成分具有調節免疫系統、抗氧化清除自由基、保護肝臟等作用[7]。GAB是從靈芝中提取得到的一種羊毛甾烷型三萜化合物。研究表明，GAB對多種腫瘤細胞均具有較強的生長抑制作用[8]。Liu等[9]研究發現，GAB能夠通過逆轉腫瘤側群細胞中ATP結合盒子家族G成員-2的多藥耐藥活性，進而提高肝癌側群細胞對化療藥物的治療敏感性。

基于上述發現，筆者推測GAB也能夠提高胃癌側群細胞對化療藥物的治療敏感性，但是目前幾乎未見相關報道。因此，本研究首次以胃癌側群細胞為研究對象，觀察GAB對其生長抑制效果，并從干性維持核心蛋白Oct4的類泛素化修飾角度解讀GAB增加胃癌側群細胞化療敏感性的內在機制，以期為未來靶向胃癌側群細胞的中草藥研發提供實驗參考和借鑒。

本研究以具有腫瘤干細胞特征的CD133+的SGC-7901胃癌側群細胞為研究對象[10]。首先利用流式細胞術分選得到該類細胞，并GAB處理96 h。通過繪制克隆球直徑變化曲線發現，GAB能夠明顯抑制胃癌側群細胞克隆球的生長，進一步的流式細胞周期分析發現，GAB能夠誘導胃癌側群細胞的細胞周期時相由G0/G1期向G2/M期發生偏移。為進一步驗證該結論，本研究檢測了不同細胞周期時相的標記蛋白Cyclins的蛋白表達情況。結果表明，G0/G1期早期標志蛋白Cyclin D1的蛋白水平在正常胃癌側群細胞中高表達，但在GAB處理后該蛋白表達水平明顯下降，與此同時，G1/S過渡期標志蛋白Cyclin E1，G2期標志蛋白Cycin A2以及G2/M過渡期標志蛋白Cyclin B1的蛋白水平均明顯升高。提示，GAB能夠顯著誘導胃癌側群細胞的細胞周期時相發生后移。為進一步了解GAB誘導發生的細胞周期時相后移是否能夠提高胃癌側群細胞對傳統化療藥物的敏感性，本研究檢測了順鉑對CD133+胃癌側群細胞的IC50，結果發現GAB處理能夠使順鉑對胃癌側群細胞 IC50從 69.84 μg/mL下降至35.67 μg/mL。該結果表明，GAB的確可以通過誘導胃癌側群細胞的細胞周期時相后移，使其自身暴露于化療藥物順鉑的殺傷范圍，進而增加化療敏感性。

蛋白質類泛素化修飾是近年來發現的一類參與蛋白質構象穩定、核漿移位、拮抗泛素水解等多種功能的蛋白質翻譯后修飾形式[11]。Wei等[12]報道維持細胞干性功能的核心Oct4為SUMO-1的調節靶蛋白之一。Oct4蛋白上特定賴氨酸位點被SUMO結合修飾后可使其自身的蛋白構象發生改變，避免被泛素介導的蛋白水解酶降解，進而維持在較高的水平，參與干細胞干性維持。基于上述分析，本研究推測Oct4的SUMO化修飾調節機制可能參與了GAB誘導的胃癌側群細胞周期時相后移過程，因此該研究也檢測了SUMO-1和Oct4的蛋白表達水平。結果表明GAB的確能夠誘導Oct4蛋白的去SUMO化修飾，進而促使Oct4蛋白降解，最終降低胃癌側群細胞的干性維持能力。

總之，本研究發現GAB能夠通過誘導Oct4去SUMO化修飾途徑激活G0期的胃癌側群細胞，促使其發生細胞周期時相后移，進而暴露于常規化療藥物順鉑的作用區間，實現對胃癌側群細胞化療增敏效果。該研究為未來基于GAB的中草藥研發及胃癌側群細胞的靶向治療提供了重要的參考價值和實驗借鑒。