辣椒堿通過上調NLRP3炎性小體誘導胃癌MGC-803細胞轉移

趙 麗，華 夏，譚 曄

（恩施土家族苗族自治州中心醫院急診科，恩施 445000）

胃癌是中國常見的惡性腫瘤之一，并且在全球腫瘤患者中占據第3位[1]。流行病學調查發現中國胃癌患者例數占全球的42%左右，每年死亡人數更是遠遠超過30萬[2]。研究發現長期炎性因子的浸潤是胃癌發生發展的一個重要誘導機制[3-4]。飲食習慣及生活方式也是誘發炎癥或者腫瘤的重要原因，其中辣椒堿為辣椒中的主要活性成分[5]，長期使用過多的辣椒容易誘發胃黏膜炎癥反應，并且一定濃度范圍的辣椒堿可以誘發一系列炎癥因子的高表達，還具有抗凋亡及促進血管生成等作用[6-7]。早期發現辣椒堿能誘導胃癌細胞的增殖[8]，但是與胃癌細胞轉移的相關研究較少，并且炎癥可以促使腫瘤細胞的轉移[9]。筆者主要探討核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）炎性小體是否參與辣椒堿促使人胃癌MGC-803細胞轉移，證實炎性通路在辣椒堿誘發MGC-803細胞轉移的作用。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 人胃癌MGC-803細胞 購買于武漢巴菲爾生物有限公司（來自美國ATCC細胞庫）。

1.1.2 實驗試劑 辣椒堿（山東綠葉制藥，批號H20060291，純度≥99%），白細胞介素-1β（IL-1β）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（CUSABIO公司，批號 CSB-E04505m），白細胞介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒（CUSABIO公司，批號CSB-E05207a），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒（CUSABIO 公司，批號 CSB-E02308d），活性氧（ROS）抑制劑 N-乙酰半胱氨酸（NAC，美國Sigma公司，批號CT-20161006），NLRP3抑制劑（美國 Sigma公司，批號CZ-20170614），NLRP3（批號 ab0252411）、細胞鈣依粘連蛋白（E-cadherin，批號 ab1025855）、波形蛋白（Vimentin， 批 號 ab1102239）、β -actin （ 批 號ab2255027）抗體購自英國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 MGC-803細胞培養于10%胎牛血清（FBS）的完全達爾伯克改良伊格爾（DMEM）培養基（含1%的105 U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素）中，培養箱設置為37℃、5%CO2的恒濕條件，采用15 μmol/L辣椒堿干預MGC-803細胞48 h。采用1 μmol/L MCC950 及 1 μmol/L NAC 分別與辣椒堿共同干預MGC-803細胞48 h。

1.2.2 ELISA實驗 取各組細胞（對照組、辣椒堿組、MCC950+辣椒堿組）培養液上清100 μL加入包被好的ELISA板中，37℃反應2 h，用洗滌液洗板3次，每次2 min。扣干后加入生物素化的一抗37℃反應1 h，用洗滌液洗板3次，每次2 min。扣干后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，37℃反應30 min，用洗滌液洗板5次，每次2 min。最后加入3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺（TMB）顯色劑，反應時間為15～30 min，加入終止液，酶標儀450 nm波長下檢測吸光度值。

1.2.3 Transwell實驗 將對數生長期的MGC-803細胞接種于Transwell小室，貼壁后加入辣椒堿溶液及MCC950/辣椒堿混合液，藥物干預上室MGC-803細胞48 h后，結晶紫染色測定遷移的細胞個數。

1.2.4 Western Blot實驗 收集各組細胞，采用RIPA裂解液在冰上進行細胞裂解30 min，4℃、13 000 g離心力下離心15 min，吸去蛋白上清自新離心管中，采用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒進行蛋白濃度測定，加入適量樣品緩沖液混勻，100℃煮沸7 min。用12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠塊電泳分離蛋白，完成后轉膜。切割不同分子量目的蛋白至對應一抗溶液中（稀釋比均為1∶3 000），4℃震蕩過夜，采用HRP標記的二抗（稀釋比 1∶1 000）37℃孵育 1 h，TBST洗膜 3次后加入ECL顯影液，采用X線曝光。

1.2.5 活性氧ROS檢測 辣椒堿溶液及MCC950/辣椒堿混合液共同處理細胞48 h后，收集細胞懸浮于稀釋好的2，7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA，1∶1 000）液中，37℃細胞培養箱內孵育30 min。用無血清DMEM培養基洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。流式細胞儀檢測熒光強度。

1.3 數據分析 采用SPSS 20.0統計學軟件處理數據，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 辣椒堿誘導MGC-803細胞產生炎性因子 辣椒堿組細胞培養液中IL-1β、IL-6及TNF-α含量相對于對照組顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

2.2 辣椒堿通過上調NLRP3炎性小體誘導MGC-803細胞遷移 Western Blot實驗結果發現辣椒堿組細胞中NLRP3炎性小體表達水平顯著升高，同時E-cadherin蛋白表達顯著降低、Vimentin蛋白表達明顯升高，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。圖3顯示辣椒堿組細胞遷移細胞數相對于對照組顯著增多，而辣椒堿+MCC950組細胞遷移數相對于對照組沒有明顯差異，并且發現MCC950干預細胞后，培養液中炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α含量與對照組比較沒有明顯差異（P＞0.05），結果見圖4。還進一步發現MCC950聯合辣椒堿共同干預細胞后，NLRP3炎性小體表達水平顯著降低，同時E-cadherin蛋白表達顯著升高及Vimentin蛋白表達明顯降低。

圖1 MGC-803細胞培養液中炎性因子水平Fig.1 Levels of inflammatory cytokines in MGC-803 cell medium

圖2 NLRP3、E-cadherin及Vimentin蛋白表達Fig.2 Expression of NLRP3，E-cadherin and Vimentin proteins

2.3 辣椒堿通過增加細胞內ROS的表達激活NLRP3炎性小體 辣椒堿組細胞內ROS含量顯著升高，而NAC可以逆轉辣椒堿誘導的ROS含量及NLRP3表達上調，結果見圖5、圖6。

圖3 MGC-803細胞遷移能力（×200）Fig.3 Metastasis ability of MGC-803 cells（×200）

圖4 MGC-803細胞培養液中炎性因子水平Fig.4 Levels of inflammatory cytokines in MGC-803 cell medium

圖5 不同組間ROS水平比較Fig.5 Comparison of ROS in different groups

3 討論

圖6 不同組間NLRP3表達水平比較Fig.6 Comparison of NLRP3 expression in different groups

腫瘤細胞的遷移及侵襲是腫瘤進一步惡化的重要標志，并且細胞上皮間質轉化（EMT）在腫瘤細胞的遷移侵襲過程中起著關鍵作用[10]。在腫瘤細胞出現轉移過程中EMT往往處于活化狀態，表現在間質樣標志物Vimentin的表達升高、上皮樣標志物E-cadherin表達降低等[11]。研究發現炎性反應可以促使腫瘤細胞的轉移，而且炎性因子的產生還能夠加快EMT進程，于是腫瘤炎癥微環境促使了腫瘤細胞的侵襲及轉移能力[12]。NLRP3炎性小體是主要的炎癥調控元件，其表達上調會激活Cleaved casapse-1的水解成熟，從而誘導炎癥因子IL-1β及炎性通路NF-κB的活化[13]。前期研究報道NLRP3炎性小體在腫瘤發生發展過程中發揮著重要作用，并且其表達含量的提升可誘導胃腫瘤細胞的遷移及侵襲[14]。本研究發現用辣椒堿干預MGC-803細胞48 h后，NLRP3炎性小體表達顯著上升，并且間質樣標志物Vimentin表達升高、上皮樣標志物E-cadherin表達降低，說明辣椒堿可誘導MGC-803細胞發生EMT，同時MGC-803細胞培養液中炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α含量顯著升高，說明辣椒堿可加劇MGC-803細胞炎癥反應。然而采用NLRP3的特異性抑制劑MCC950干預MGC-803細胞后，可以解除辣椒堿誘導的細胞轉移能力。

相關研究提示，氧化應激可以促使腫瘤細胞死亡達到腫瘤治療的目的，作為機體發生氧化應激反應的主要分子，ROS能夠誘導腫瘤細胞凋亡、壞死及自噬性死亡進而抑制腫瘤的惡化[15]。然而近年來報道ROS可以作為第二信使參與細胞內多種生理調節，進而介導腫瘤的遷移及侵襲[16]。機體產生的ROS可誘導NLRP3炎性小體活化，當細胞內NLRP3炎性小體受到ROS刺激后會使無活性的caspase-1前體進一步活化為有活性的caspase-1，后者能夠把無活性的IL-1β前體剪切為IL-1β而分泌到細胞外，進而導致下游炎性通路的活化[17]。本研究發現辣椒堿可以促使胃腫瘤細胞內ROS的升高，而加入NAC干預細胞后能改善辣椒堿誘導的ROS增高，并且還減弱了細胞內的炎癥反應，提示ROS在辣椒堿介導的胃癌轉移中發揮了關鍵性作用，但辣椒堿誘導ROS產生的分子機制尚存在疑惑，需更深層次的研究。

總之，本文研究發現辣椒堿能誘導ROS產生進而激活NLRP3炎性小體，從而誘導胃腫瘤細胞發生EMT并促進胃癌轉移。