靖州楊梅果酒發酵菌種篩選、鑒定及發酵性能研究

陽秀蓮劉 偉林樹花陳萬能張菊華,3

(1. 湖南大學研究生院隆平分院，湖南 長沙 410125；2. 湖南省農業科學院農產品加工研究所， 湖南 長沙 410125；3. 果蔬貯藏加工與質量安全湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410125； 4. 湖南省靖州縣湘百仕酒業有限責任公司，湖南 懷化 418400)

楊梅(MyricarubraSieb. & Zucc.)為楊梅屬楊梅科喬木或灌木常綠植物。中國楊梅產量占世界總產量的98%以上[1]，浙江、湖南等省份均有分布。目前湖南楊梅栽培面積約1.0×104hm2，其中，靖州縣栽培面積達到6 667 hm2，年產楊梅6.0×104t，已成為中西部地區最大的產區。楊梅酸甜可口營養豐富，不僅能生津止渴、消食解暑[2]，還具有抗氧化[3]、降血糖[4]、抑癌[5]等功效。由于果實裸露，易受到機械損傷和微生物侵染，不耐貯運且上市集中，極大地制約了楊梅產業發展。楊梅酒加工有助于減少采后損失、改善楊梅營養價值及延長貨架期，提高水果產業附加值[6]。

發酵型楊梅酒是以楊梅汁為原料，加入優質的釀酒酵母發酵而成，口感柔和，營養豐富，具有楊梅果的典型性。發酵型果酒品質取決于所選擇的酵母性能，酵母菌株的起酵、產酒、產香、耐性等特性不同，其作用也相差甚遠。選育發酵性能優良、適合特定水果發酵的專用酵母已成為果酒釀造的研究熱點[7]。釀酒酵母分離篩選主要是在酵母菌活躍存在的地方，如成熟水果、鮮榨果汁、果園土壤、空氣和發酵醪[8]。目前，已從草莓[9]、人參果[10]、獼猴桃[11]等水果中篩選出發酵專用酵母，并開展了發酵性能和工藝優化等的研究。但目前市場上幾乎沒有楊梅果酒專用酵母，分離篩選適宜釀造楊梅酒菌種的研究也鮮有報道。僅杜晶等[12]從楊梅果園周邊環境及自然發酵醪中篩選鑒定4株酵母(1株釀酒酵母和3株非釀酒酵母屬酵母)，其發酵性能還有待研究。

本研究為挖掘靖州楊梅主產區的酵母資源，擬從土壤及果品表面開展酵母菌株的篩選，篩選出起酵速率快、酒精轉化率高、酒精耐受力高、抗SO2能力強和風味獨特的優質楊梅釀酒酵母，并進行菌株鑒定，確定菌株的最佳生長條件，以期為工業化生產提供優良發酵劑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集

從靖州縣多個楊梅園采集鮮果、楊梅葉和土壤。

1.1.2 培養基

麥芽汁培養基、酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基(YPD培養基)、酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養基(YPD液體培養基)：自然pH值，115 ℃高壓滅菌15 min，廣東環凱微生物科技有限公司；

2,3,4-氯化三苯基四氮唑(TTC)上層培養基：添加0.05% TTC試劑至滅菌冷卻約50 ℃的YPD培養基中混合均勻；

TTC下層培養基：YPD培養基。

1.1.3 主要試劑與儀器

蔗糖：食品級，大潤發超市；

TTC：分析純，上海靈錦精細化工有限公司；

其他試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

智能恒溫恒濕培養箱：HWS型，寧波江南儀器廠；

全自動色度分析儀：Color Quest XE型，美國HunterLab公司；

紫外可見分光光度計：UV-1800型，島津儀器(蘇州)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株分離

(1) 樣品處理：分別稱取土壤、楊梅果、樹葉各10 g于90 mL YPD液體培養基中，振蕩培養24 h，取上清液梯度稀釋，涂布于YPD培養基上，倒置培養2～3 d[13]。楊梅果實破碎去核榨汁，裝入無菌三角瓶中發酵，不定期振搖，發酵第1，3，5，7天取樣，梯度稀釋涂布于YPD培養基上，培養2～3 d。培養溫度均為28 ℃。

(2) 分離純化：挑選具有典型酵母特征的菌落進行平板劃線，純化后接種至YPD斜面培養12～24 h，置于4 ℃冰箱保存[14]。

1.2.2 酵母篩選

(1) 一級篩選(TTC顯色法)：參考文獻[15]。

(2) 二級篩選(杜氏管法)：參考文獻[12]修改如下，菌種添加量為5%(菌液濃度為107CFU/mL)，楊梅汁的SSC為7%，pH為3.0，85 ℃水浴加熱15 min后迅速冷卻。

(3) 三級篩選(糖發酵試驗)：參考文獻[16]修改如下， 5 mL 的豆芽汁中分別加入葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖，不加糖的豆芽汁為對照組。

(4) 四級篩選(楊梅酒發酵法)：活化酵母菌液，接種量為5%，SO2添加量為50 mg/L、加糖量為170 g/L，楊梅汁pH為2.7，主發酵溫度 24 ℃，主發酵停止后測定總糖、總酸、總花色苷、色差值并進行感官評價。

1.2.3 形態學觀察 將斜面保藏的酵母在YPD平板上劃線，28 ℃培養3～4 d后觀察菌落形態，并制成菌懸液，在10×100倍顯微鏡下觀察菌株的形態及出芽方式等。

1.2.4 分子生物學鑒定 采用上海生工Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒提取菌株DNA，對26S rDNA中的D1/D2區域基因進行序列擴增，PCR產物用1%的瓊脂糖電泳進行檢測，經純化后送至生工生物工程(上海)公司測序，在美國國家生物技術信息中心(NCBI)的BLAST程序中比對，用MEGA 4.0繪制系統發育樹，確定菌株的種屬。

1.2.5 酵母發酵性能

(1) 生長曲線的測定：參考文獻[17]修改如下，將菌液以1%的接種量分別接種至18瓶麥芽汁培養基中，設置1瓶未接種的發芽汁為空白對照，28 ℃振蕩培養，前期每2 h取樣，后期每4 h或6 h間隔取樣，據實際情況稀釋，測定麥芽汁培養基的OD值(600 nm)，重復3次，繪制生長曲線。

(2) 酵母耐糖、SO2、pH、酒精性能研究：將菌株活化后接種至YPD液體培養基中，28 ℃培養12 h，接種量為3%，分別添加菌液至含SSC(16%，20%，24%，28%，32%)的YPD液體培養基、含SO2(40，80，120，160，200 mg/L)的YPD液體培養基、含酒精(8%，10%，12%，14%，16% Vol)的YPD液體培養基和不同pH值(2.0，2.5，3.0，3.5，4.0)的YPD液體培養基中。28 ℃振蕩培養48 h，取樣稀釋10倍，測量其OD值(600 nm)，重復3次。

1.2.6 檢測方法

(1) 總糖：采用直接滴定法[18]5。

(2) 總酸：采用電位滴定法[18]7。

(3) 酒精度：采用酒精計法[18]4。

(4) 色差值：采用色差儀測定。

(5) TSS：采用手持糖度儀測定。

(6) pH值：采用pH計測定。

(7) 總花色苷：采用pH示差法[19]。

2 結果與分析

2.1 酵母的分離

從靖州縣不同楊梅園中采集樣本共67份，經梯度稀釋涂布、分離純化和菌落形態觀察后共得到172株菌，其中土壤43株，楊梅葉32株，鮮果59株，發酵汁38株。

2.2 酵母的篩選

2.2.1 一級篩選 利用TTC顯色原理對酵母菌株的活性和產酒精能力進行篩選。菌落顏色越深，表明其活性越高，產酒精能力越強；呈淺紅色或無色，表明其活性較低，產酒精能力較弱或不產酒精[20]。TTC顯色反應后的菌株呈色情況如圖1所示，共有65株呈深紅色，49株呈玫紅色，37株呈淡粉色，21株基本無顏色變化。TTC顯色法中選取菌落顏色呈深紅色的65株菌株進行下一步篩選。

圖1 TTC平板顯色篩選

2.2.2 二級篩選 酵母發酵過程中產生CO2氣體，杜氏管中氣泡的體積和數量可直接反映菌株發酵的起酵速度和發酵能力[21]。通過杜氏管篩選試驗，篩選出能在低pH的楊梅汁中發酵產氣，且在48 h內充滿杜氏管的菌株[22]。如表1所示，19株在48 h內充滿杜氏管，36株規定時間內未充滿杜氏管或沒有明顯產氣現象。選取充滿杜氏管的19株進行下一步篩選。

表1 杜氏管產氣情況?

? “+”表示杜氏管已充滿；“-”表示杜氏管未充滿。

2.2.3 三級篩選 碳源的利用能力是考察菌株性能的一個重要指標，在糖發酵試驗中，菌株對各類糖的利用程度不一[23]。如表2所示，72 h內充滿杜氏管的菌株，蔗糖組有9株，葡萄糖組有9株，果糖組有11株，麥芽糖組和對照組無充滿現象。結果表明，果糖最易被菌株利用，起酵速度快且產氣速率高，蔗糖和葡萄糖次之。但考慮工廠實際成本，添加蔗糖(白砂糖)作為菌株能量來源最為經濟，故選取能有效利用蔗糖的9株菌株進行下一步試驗。

表2 不同糖發酵72 h杜氏管產氣結果?

? “-”表示杜氏管中沒有氣泡產生；“+”表示杜氏管中有氣泡產生但未被充滿；“√”表示杜氏管已被充滿。

2.2.4 四級篩選 通過比較9株菌發酵果酒的各項指標，篩選出發酵能力強、香氣濃郁、色澤鮮亮的菌株。

由圖2可知， DY5與JW14發酵果酒在色澤和香氣特征方面最為突出，綜合感官評分高，具有濃郁和諧的果香和酵母香，但酒味不突出；RY1具有較好的酒香味，其果香不明顯，滋味和風格最好，綜合評分較高；其他6株發酵果酒整體評分偏低，風格和滋味特征不顯著。結果表明，JW14與DY5色澤顯著；DY5香氣顯著；RY1在風格與滋味上顯著，此3株菌株的綜合感官評分高于其他菌株。

圖2 果酒感官評分雷達圖

通過色差L*、a*、b*值(圖3)結合總花色苷(表3)含量可知，楊梅汁的顏色最深，L*值最小，總花色苷含量最高，為187.491 mg/L。在發酵過程中，發酵溫度、SO2添加量、pH、酵母菌株等因素會引起果酒色澤和花色苷含量的變化[24]。在9株酵母發酵果酒中，顏色最深的為DY5和JW14，其色差值相差較小，但DY5總花色苷含量最高；RY1顏色稍淺，可能是該菌株活性高對花色苷的降解作用大而導致；其他果酒花色苷含量低，色澤較差。

圖3 發酵楊梅酒的色差值比較

表3 菌株發酵楊梅酒的理化指標?

? “-”表示該指標未檢測。

楊梅酒理化指標如表3所示，RY1酒精度最高，DY5和JW14次之，其他楊梅酒的酒精度皆低于6% Vol；總糖含量RY1最低，DY5和JW14較低，其他楊梅酒的總糖含量比RY1高2.7～3.4倍。在初始糖含量相等的情況下，總糖含量越低，酒精度越高，則菌株的發酵能力越強。由于楊梅汁的總酸含量較高，采用小容器發酵且未進行降酸處理，導致9株菌發酵的楊梅酒口感偏酸[25]。

綜上，RY1菌株的產酒精能力強，感官評分高，酵母活性好，適合普通的楊梅果酒釀造。DY5菌株和JW14菌株產酒精能力較強，果酒中果香濃郁，總花色苷含量高，酒體顏色艷麗，感官評分高，適合釀造低度數果酒飲料或協助增香。此3株酵母具有較好的應用前景，故選取RY1、DY5、JW14 3株菌株進行形態學、分子生物學鑒定。

2.3 形態學鑒定

DY5、RY1、JW14 3株菌株的形態見圖4。

(1) DY5菌株：菌落呈圓形，菌株平整，乳白色，中心處顏色較深，邊緣整齊，菌落光滑濕潤易挑起，有濃郁的酵母香；細胞形態為紡錘狀，出芽生殖。

(2) RY1菌株：菌落呈圓形，中心點凸起，色澤呈乳白色，顏色均勻，邊緣整齊，菌落光滑濕潤易挑起，有輕微的酒香；細胞形態為球形，出芽生殖。

(3) JW14菌株：菌落呈圓形，中心點微凸起，乳白色，邊緣處顏色微淺，顏色似同心圓狀，表面光滑不黏稠，不易挑起，有較濃郁的酵母香；細胞形態為紡錘狀，出芽生殖。

2.4 分子生物學鑒定

以NL1和NL4為引物，對篩選得到的酵母菌進行了26S rDNA D1/D2區域序列擴增,得到的電泳圖如圖5所示。

圖4 酵母菌形態特征圖

將所得堿基序列在NCBI上比對，RY1的序列長度為588 bp，確定該酵母為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；DY5的序列長度為586 bp，確定該酵母為仙人掌有孢漢遜酵母(Hanseniasporaopuntiae)；JW14的序列長度585 bp，確定該酵母為有孢漢遜酵母屬(Hanseniasporapseudoquilliermondii)，各株菌系統發育樹如圖6～8所示。

2.5 酵母發酵性能

2.5.1 生長曲線測定 如圖9所示，菌株RY1與菌株DY5活性較高，前2 h為延滯期，之后迅速進入對數期，RY1對數期時長為16 h，在18 h后進入穩定期，其進入對數期早，時間長；DY5菌株對數期時長為14 h；JW14菌株的延滯期稍長，呈指數增長速度較慢，在16 h以后趨于平穩。3株菌株在48 h內沒有明顯的衰亡期，與前人[26-27]研究結果一致。

1. JW14菌株 2. DY5菌株 3. RY1菌株 M. Mark

2.5.2 高糖耐受性 在楊梅果酒發酵過程中需添加蔗糖，為酵母的生長代謝提供充足的能量。糖原添加量過高會降低酵母活性，抑制其生長。耐受較高濃度糖溶液的菌株，其產酒精能力強，可降低發酵產物對菌株本身的毒害和抑制作用[28]。由圖10可知，3株酵母菌在SSC為16%時，OD值最大，表明該糖濃度下菌株生長旺盛；隨著SSC增加，OD值均有所減小；在SSC為32%時，RY1菌株與DY5菌株的OD值略有下降，JW14菌株的曲線變化較大，OD值最小。結果表明，含糖量越高，酵母在高滲透壓的環境下其生長活性受到了一定的抑制，其中RY1具有在高糖溶液下發酵的潛力，DY5菌株和JW14菌株適合在正常糖含量的環境下發酵。

圖6 菌株RY1系統發育樹

圖7 菌株DY5系統發育樹

圖8 菌株JW14系統發育樹

圖9 菌株生長曲線的測定

圖10 菌株高糖耐受性

2.5.3 SO2耐受性 在果酒發酵過程中，SO2添加量過低，發酵液易受到雜菌的污染；SO2添加量過高，酵母的生長繁殖受到抑制，發酵進程緩慢[29]。由圖11可知，3株菌株的OD值隨SO2添加量增加而有所減小，在SO2添加量為200 mg/L 時，仍保持較高的活性，OD值相差較小。加入高濃度的SO2，菌株前期受到抑制，在震蕩培養過程中SO2加速揮發，其抑制能力減弱，菌株正常生長，在48 h后測其OD值，數值變化不大。結果表明3株酵母均能耐受200 mg/L的SO2添加量。

圖11 菌株SO2耐受性

2.5.4 低pH耐受性 耐酸性是考察酵母性能的一個重要指標，楊梅果汁中的pH值普遍較低，為3.0左右，菌株的低pH耐受性強，可降低發酵液被污染的風險。由圖12 可知，RY1菌株最適生長pH值為3.0，DY5菌株和JW14菌株的最適生長pH為3.5。3株菌株都能耐受pH 2.0的環境，在pH 2.5及以上能較好地生長，在pH 3.0 左右生長旺盛，此pH與楊梅汁相近，因此均適合楊梅酒發酵。

圖12 菌株pH耐受性

2.5.5 酒精耐受性 酵母菌在產酒精的同時，自身會受到脅迫作用，酵母細胞的生長會因酒精的毒害作用而受到抑制，從而影響發酵液中酒精的形成[30]。菌株對酒精的耐受性分為3個等級：只能耐受酒精含量為6% Vol以下的菌株，乙醇耐受性差；能耐受6%～10% Vol，菌株耐受性一般；能耐受11% Vol及以上的對酒精具有高耐受性[31]。由圖13可知，菌株RY1、DY5與JW14隨著酒精體積分數增大，OD值稍有下降，在酒精含量為16% Vol時，OD值下降不明顯，菌株仍保持較好的活性，說明3株菌株均能耐受高酒精含量的溶液，能滿足楊梅酒的釀造需求[32]。

圖13 菌株酒精耐受性

綜上所述，通過測定RY1、DY5、JW14菌株在高糖、低pH、高SO2添加量及高酒精體積分數環境下的耐受性，發現釀酒酵母RY1的活力最高，耐受性最強，能在SSC 36%、pH 2.0、SO2添加量200 mg/L、酒精含量16% Vol 的環境下保持較好的生長活性；JW14酵母活性較低，其耐受性相對較差，勉強能耐受32%的高糖溶液和pH 2.0 的低酸溶液；DY5酵母活性及耐受性介于菌株RY1和JW14之間，3株酵母的性能符合果酒釀造要求，適用于發酵楊梅酒。

3 結論

本研究篩選出3株綜合性能優良的菌株，經分子生物學鑒定：菌株RY1為釀酒酵母屬(Saccharomycescerevisiae)，菌株DY5為仙人掌有孢漢遜酵母屬(Hanseniasporaopuntiae)，菌株JW14為有孢漢遜酵母屬(Hanseniasporapseudoquilliermondii)。通過耐受性試驗，發現RY1酵母活性高，產酒精能力及耐受性強，香氣協調，適合發酵楊梅果酒；DY5和JW14酵母酒精發酵能力一般，具有較好的產香能力，適宜發酵低度數楊梅飲料和輔助發酵增香。

但有關湖南地區酵母菌的生理生化、發酵特性及其進一步利用仍需繼續研究。