HS-SPME-GC-MS結合自動解卷積技術分析阿膠中的揮發性成分

張鵬云李 蓉龍春霞林淑綿張 峰

(1. 中山出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，廣東 中山 528400；2. 廣東藥科大學公共衛生學院， 廣東 中山 528458；3. 中國檢驗檢疫科學研究院食品安全研究所，北京 100176)

阿膠(CollaCoriiAsini) 是一種名貴的中藥材，又名驢皮膠、盆覆膠，由馬科動物驢 (EquusasinusL.)的干燥皮或鮮皮經煎煮、濃縮而制成[1]。阿膠被稱為補血圣藥，藥食兩用，在臨床上可用于治療妊娠胎漏、勞嗽咯血、肺燥咳嗽，便血崩漏等疾病[2]。藥理研究表明，阿膠具有增加白細胞[3]、補血造血[4]、抗衰老[5]等作用。而阿膠在提取過程中驢皮中的膠原蛋白不斷水解，水解程度不同，提取物的粗糙感、雜質含量、儲存時間、堿性揮發性物質的揮發程度也不同，就會產生不同質量的阿膠產品[6]。此外阿膠帶有濃重的腥氣，氣味并不能被大多數人接受，但是根據其腥氣的化學組成進行針對性調控，可以改善阿膠的風味[7]。因此，研究阿膠的揮發性成分不但有助于理解阿膠的藥物作用機制，還可以用來判斷其質量，改善其風味，對阿膠產品的研發與發展有重要的指導意義。

近年來，中國已有學者對阿膠香氣成分有所研究，如毛跟年等[8]對阿膠腥味物質進行了分析，鑒定出23種物質；王進等[9]分析了 3個品牌阿膠揮發性成分，共鑒定出49種成分，并利用氣相色譜—嗅聞技術鑒定出14種活性香氣成分；佘遠斌等[10]比較了5個品牌阿膠香氣成分的特征與差異，并鑒定出65種化合物，但上述揮發性成分是由蒸餾法或同時蒸餾萃取法制得，操作復雜并使用大量溶劑。雖然肖作兵等[11]曾利用頂空—固相微萃取法提取了9種阿膠揮發性物質，但是未分析不同因素對阿膠揮發性成分萃取效果的影響，且在定性過程中只運用了譜庫對照。而阿膠揮發性成分復雜，色譜分離能力又有限，一些極性相似的組分色譜峰會重疊，僅根據譜庫檢索來確認化合物，會使定性結果不準確[12]。

本研究擬采用頂空—固相微萃取法(head space-solid phase micro-extraction，HS-SPME)提取阿膠揮發性成分，利用單因素和正交試驗研究樣品量、萃取溫度、萃取時間、平衡時間、解吸時間對萃取效果的影響，并確定HS-SPME-GC-MS分析阿膠揮發性物質的較優條件。再利用自動質譜退卷積定性系統(AMDIS)對揮發性成分總離子流圖進行解卷積處理，提取未知組分更“純凈”的質譜圖，之后通過譜庫檢索匹配，結合保留指數(Retention index，RI)來定性[13-14]，使定性結果的準確度進一步提高。旨在為阿膠揮發性成分的提取與鑒定提供參考方法，為阿膠的鑒別與品質評價提供技術保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東阿阿膠塊(批號：1605003)：山東東阿阿膠，常溫儲存；

正構烷烴混合標準品(C7～C40)：美國O2si公司。

1.2 儀器與設備

氣相色譜—三重四級桿串聯質聯儀(GC-MS/MS)： TSQ 8000型，配電子電離源及Xcalibur數據處理系統、TRIPLUS RSH自動進樣器，美國Thermo Fisher公司；

50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭：美國Supelco公司；

2014 NIST 2.2標準質譜庫：美國國家標準與技術研究所。

1.3 試驗方法

1.3.1 頂空固相微萃取法 先將阿膠塊粉碎，然后準確稱取一定量阿膠粉末置于20 mL頂空瓶中(配有聚四氟乙烯墊的螺紋密封蓋)，自動進樣器將頂空瓶放在具有一定溫度的孵化爐中平衡數分鐘后，將已老化的50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭迅速插入樣品瓶頂空部分進行熱吸附，然后將萃取頭插入氣相色譜進樣口，在250 ℃條件下進行解吸，最后進入GC-MS/MS系統進行分離檢測。

1.3.2 萃取條件的優化 在預試驗基礎上，選取揮發性物質的總峰面積和峰數目為考察指標，研究不同因素對阿膠揮發性物質萃取效果的影響。

(1) 樣品量：采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，在萃取溫度50 ℃，萃取時間30 min，平衡時間10 min，解吸時間5 min的條件下，考察不同樣品量(2，3，4，5，6 g)的萃取效果，每個水平重復3次。

(2) 萃取溫度：在樣品量優化結果基礎上，考察不同萃取溫度(50，60，70，80，90 ℃)的萃取效果，每個水平重復3次。

(3) 萃取時間：在樣品量和萃取溫度優化結果的基礎上，考察不同萃取時間(30，40，50，60 min)的萃取效果，每個水平重復3次。

(4) 平衡時間：在樣品量，萃取溫度和萃取時間優化結果的基礎上，考察不同平衡時間(5，10，15，20 min)的萃取效果，每個水平重復3次。

(5) 解吸時間：在以上因素的優化條件下，考察不同解吸時間(3，5，7，9 min)的萃取效果，每個水平重復3次。

1.3.3 GC-MS分析條件

(1) 色譜條件：TR-PESTICIDE彈性石英毛細柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持2 min，然后以5 ℃/min的速率升溫至180 ℃，保持2 min，再以15 ℃/min的速率升溫至250 ℃并保持3 min；柱流速1.2 mL/min，分流比10∶1；進樣口溫度250 ℃；載氣為高純度(99.999%)氦氣。

(2) 質譜條件：EI離子源；離子源溫度280 ℃；傳輸線溫度280 ℃；電子轟擊能量70 eV；全掃描；質量掃描范圍m/z35～450，溶劑延遲3 min。

1.3.4 定性分析 應用自動質譜退卷積定性系統AMDIS對阿膠揮發性物質總離子流圖(TIC)自動進行反卷積處理，所分辨的質譜在2014版NIST2.2標準譜庫中檢索，根據匹配度和保留指數進行核對，只選擇正匹配和反匹配均>800的物質，并用峰面積歸一化法計算阿膠各揮發性物質的相對含量。

保留指數是C7～C40正構烷烴混標在和阿膠樣品相同的分析條件下進樣后，自動質譜退卷積定性系統(AMDIS)根據正構烷烴的保留時間，自動計算出各揮發性組分的保留指數。

2 結果與討論

2.1 HS-SPME條件的選擇

2.1.1 樣品量對萃取效果的影響 由圖1可知，隨著阿膠樣品量的增加，揮發性成分的總峰面積和峰數不斷增大。當樣品量超過5 g時，揮發性成分的總峰面積和總峰數變化趨勢不明顯，這是因為此時吸附和解吸附已達到平衡，揮發性成分處于飽和狀態，即使再多的樣品，揮發性成分的總量還是一定的。因此選擇5 g為較佳樣品量，不但保證了萃取效果，還節約了樣品。

圖1 樣品量對阿膠揮發性成分萃取效果的影響

Figure 1 Effect of sample amount on the extraction of volatile compounds fromCollaCoriiAsini

2.1.2 萃取溫度對萃取效果的影響 由圖2可以看出，當萃取溫度不斷升高時，阿膠揮發性物質的總峰面積呈先上升后下降的趨勢，在70 ℃時達到最大值，而峰數目也呈先上升后降低的趨勢，但在80 ℃時達到最大值。這是因為溫度升高加快了揮發性組分的擴散速率，促進了萃取頭對目標物的富集吸附[15]。但萃取是一個放熱過程，高溫會降低揮發性物質在萃取頭和樣品之間的分配系數，導致萃取頭對揮發性物質的吸附量降低，另外高溫還可能使部分揮發性化合物發生變性或裂解，影響萃取結果的準確性[16]。因此造成80 ℃時，揮發性物質的峰數目較多而總峰面積卻下降的結果。綜合考慮，選擇萃取溫度為70 ℃。

2.1.3 萃取時間對萃取效果的影響 由圖3可以看出，隨著萃取時間的延長，阿膠揮發性成分的峰數目基本保持不變，而總峰面積不斷增加。當萃取時間為30～50 min 時，總峰面積上升趨勢顯著；當萃取時間超過50 min 時，總峰面積變化不明顯，說明50 min時揮發性物質已達到較平衡狀態。這可能是萃取時間過短時，揮發性化合物吸附不充分；萃取時間過長時，已經被萃取頭吸附的組分可能脫附，降低了萃取效果[17]。綜合考慮，選擇萃取時間為50 min。

圖2 萃取溫度對阿膠揮發性成分萃取效果的影響

Figure 2 Effect of extraction temperature on the extraction of volatile compounds fromCollaCoriiAsini

圖3 萃取時間對阿膠揮發性成分萃取效果的影響

Figure 3 Effect of extraction time on the extraction of volatile compounds fromCollaCoriiAsini

2.1.4 平衡時間對萃取效果的影響 由圖4可以看出，隨著平衡時間的延長，阿膠揮發性成分的總峰面積先增大后減小，在10 min時達到了最大值，而峰數目變化不明顯，在10 min 時略有增加而后基本保持不變。由此可以說明，當平衡時間為10 min時，揮發性物質在樣品和頂空部分已達到了較平衡的狀態，有利于萃取頭穩定吸附。所以將平衡時間設定為10 min。

圖4 平衡時間對阿膠揮發性成分萃取效果的影響

Figure 4 Effect of equilibrium time on the extraction of volatile compounds fromCollaCoriiAsini

2.1.5 解吸時間對萃取效果的影響 圖5顯示，隨著解吸時間的延長，阿膠揮發性成分的總峰面積和峰數目均呈先增加后減小的趨勢，且都在5 min時達到最大值。說明此時，揮發性組分已解吸完全，再延長時間反而會降低萃取效率。在同一解吸溫度下，解吸時間決定著揮發性化合物能否完全進入氣相色譜柱。若解吸時間不夠，揮發性組分解吸不完全，萃取頭上有殘留，不但影響方法的靈敏度，還會使后續樣品分析受到污染；反之，當解吸時間過長時，會導致峰形變寬，高溫下部分組分發生氧化，并且影響萃取頭的使用壽命[18]。因此，選擇解吸時間為5 min。

圖5 解吸時間對阿膠揮發性成分萃取效果的影響

Figure 5 Effect of desorption time on the extraction of volatile compounds fromCollaCoriiAsini

2.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，確定平衡時間為10 min，解吸時間為5 min，選擇萃取時間、萃取溫度和樣品量作為3個影響因素，進行三因素三水平正交試驗，正交試驗設計如表1所示。

表2為正交試驗結果，當以總峰面積作為萃取效果的考察指標時，由極差大小可知，3個因素對萃取效果的影響程度為B>A>C，即萃取溫度影響最大，萃取時間和樣品量影響次之，較優組合是A2B2C2。當以峰數目為指標時，從極差結果來看，較優組合同樣是A2B2C2，因素作用主次為B>C>A，即萃取溫度影響最大，樣品量次之。由此可以看出，當考察指標不同時，因素影響作用略有差異。

表1 正交試驗因素與水平

由于正交表中沒有A2B2C2組合結果，所以需進行A2B2C2的驗證實驗，得出總峰面積為2 314 554 005，總峰數為58，該組合結果優于正交表中的任何一個。因此，最終確定頂空—固相微萃取法萃取阿膠揮發性成分的較優組合為A2B2C2，即：樣品量5 g、萃取溫度為70 ℃、萃取時間50 min、平衡時間10 min、解吸時間5 min。

2.3 重復性試驗

采用上述優化的萃取條件，考察HS-SPME-GC-MS方法在分析阿膠樣品揮發性成分時的重復性，試驗重復6次。經計算，阿膠揮發性組分的峰面積的相對標準偏差(RSD)為2.54%～10.40%，平均值為6.25%，說明該方法具有較好的重復性。

2.4 優化條件下阿膠揮發性成分的檢測分析

在選定的HS-SPME優化條件下，對阿膠揮發性物質進行萃取，并通過GC-MS檢測分析，得到阿膠揮發性成分總離子流圖(圖6)，除去因萃取頭過熱和柱流失產生的少量硅氧烷類雜質峰后，得到阿膠揮發性成分及相對百分含量，見表3。在較優條件下阿膠共分離得到54種揮發性成分，并鑒定出其中41種成分，占揮發性成分總量的95.83%，主要包括10種吡嗪類化合物(48.95%)、8種醛類化合物(26.37%)、5種酯類化合物(8.18%)、6種酮類化合物(6.43%)及13種其他類化合物(5.90%)。其中含量最高的成分為2,5-二甲基吡嗪，占揮發性物質總面積的20.35%，其次為壬醛(16.67%)、2,3,5-三甲基吡嗪(13.80%)、3-乙基-2,5-甲基吡嗪 (9.54%)、鄰苯二甲酸二異丁酯(4.42%)、己醛(3.30%)、2-癸酮(3.23%)、苯甲醛(3.00%)、2-壬酮(1.95%)、2,2,4-三甲基戊二醇異丁酯(1.87%)，這10種成分共占阿膠揮發性物質總含量的78.14%。

表2 正交試驗結果與分析

表3 阿膠的揮發性成分?

? 參考值通過http://webbook. nist. gov /chemistry /搜索獲得。

圖6 阿膠揮發性物質的總離子流圖

吡嗪類化合物具有烤香、堅果香、咖啡香等香味特征，是氨基酸和還原糖發生Maillard反應形成的揮發性物質，在食品風味研究中具有重要價值[10]。由于阿膠的制作過程需要長時間加熱，所以產生了大量的吡嗪類化合物，本研究鑒定出了10種該類化合物。據報道[19]，吡嗪類化合物具有改善血循環、預防心血管疾病、調節脂質代謝、抗組織纖維化和抗氧化等藥理作用。根據孫惜時等[20]的研究結果，進一步證實了本研究鑒定出的2-甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪具有抗氧化活性。

經比較發現，本研究鑒定出的化合物種類與文獻[9～10]更為相似，主要為醛類和吡嗪類，但是含量差異較大。本研究中含量較高的壬醛、2,3,5-三甲基吡嗪、己醛、苯甲醛等化合物在文獻中的含量同樣較高， 而2-戊基呋喃在文獻中含量較高，但在本研究中含量相對較低，可能是由于阿膠的品牌、加工工藝不一致所致。

3 結論

本試驗確定了提取阿膠揮發性物質的較優條件為：50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭、5 g阿膠樣品、萃取溫度70 ℃、萃取時間50 min、平衡時間10 min以及解吸時間5 min。在較優條件下，鑒定出41種阿膠揮發性成分，主要為吡嗪類、醛類、酯類、酮類等化合物。本研究為阿膠的快速檢測、質量鑒定、香味調控、產品研發提供參考，但是該研究未比較不同品牌阿膠揮發性成分的差異，因此在下一步研究中將利用本研究的方法建立阿膠揮發性成分指紋圖譜，比較不同品牌之間的差異與共性，并與新鮮驢皮的揮發性成分進行對比，共同分析阿膠的質量，為阿膠揮發性成分的研究提供更加豐富的數據。