UPLC-MS/MS同時測定保健食品中洛伐他汀及其類似物

韓 智龔 蕾王會霞朱曉玲王 彬曹 琦吳婉琴

(1. 湖北省食品質量安全監督檢驗研究院，湖北 武漢 430070； 2. 湖北省食品質量安全檢測工程技術研究中心 湖北 武漢 430070)

保健食品亦稱功能性食品，具有調節人體功能的作用，但不以治療疾病為目的，適于特定人群食用[1]。據報道[2]，2018年中國保健品的產值達到4 000億元人民幣。高血脂等心腦血管疾病成為嚴重危害中國人民健康的隱形殺手，降血脂類保健食品在保健食品中占有重要地位。總黃酮、茶多酚、總皂苷、總蒽醌、粗多糖是降脂保健食品的主要功能因子，而銀杏葉、絞股藍、山楂、荷葉、澤瀉是使用頻率最多的原料[3]。市面上的保健食品名稱中常含有螺旋藻、大豆磷脂、魚油、沙蒜、紅曲等名詞，帶給消費者營養健康的感覺，受到目標人群的青睞。然而，一些不法分子通過在保健食品中非法添加化學藥物，使其功效顯著，從而達到獲取高額利潤的目的，此類非法添加物的含量往往具有隨意性，甚至超過相應藥品的推薦服用劑量，可能導致消費者發生輕微中毒，嚴重的甚至危及自身生命[4]。2018年5月，中國市場監督管理總局公布了2017年7月以來全國各地保健食品整治案件信息，非法經營行為占全部案件總數高達45.19%，其中又以非法添加藥物為主[2]。他汀類藥物是目前最有效的降血脂藥物，是不法商家非法添加的首選。他汀類藥物通過阻斷羥甲戊酸代謝途徑，促使細胞內的膽固醇合成變少，從而刺激細胞膜表面低密度脂蛋白受體活性增加，加速清除血清膽固醇，從而達到降低血脂和治療動脈粥樣硬化的目的[5-6]。

為保證降血脂類保健食品行業的良性發展，中國有關部門發布一系列保健食品監督抽檢細則，降低保健食品的安全風險。2018版《國家食品安全監督抽檢實施細則》[7]中明確將煙酸、洛伐他汀、辛伐他汀3種藥物列為日常監督抽檢項目，對應的檢測方法為食藥監辦許[2010]114號[8]，定量方法為高效液相色譜法。2018年10月，中國食品保健食品欺詐和虛假宣傳整治工作領導小組辦公室發布《食品保健食品欺詐和虛假宣傳整治》問答[9]，將美伐他汀、洛伐他汀羥酸鈉鹽、去羥基洛伐他汀作為輔助降血脂食品抽檢風險監測項目，未公布具體檢驗方法。在文獻報道中，他汀類化合物常用的檢測方法有薄層色譜法[10]、高效液相色譜法[11]、氣相色譜—質譜聯用法(GC-MS/MS)[12]、液相色譜—質譜聯用法[13-15]。這些檢測方法涵蓋洛伐他汀、辛伐他汀等常見的藥物，但是對去羥基洛伐他汀及羥基洛伐他汀羥酸鈉鹽的研究較少。于泓等[16]、鈕正睿等[17]采用超高效液相色譜—四級桿—飛行時間串聯質譜(UPLC/Q-TOF-MS)測定保健食品中的去羥基洛伐他汀及羥基洛伐他汀羥酸鈉鹽，但使用LC-MS/MS的檢測方法鮮有報道。相比于LC-TOF-MS而言，LC-MS/MS儀器價格相對廉價，方便快捷，許多實驗室都有配備。因此開發一種同時檢測洛伐他汀及其類似物的方法對促進保健食品行業健康發展，保障食品安全具有重要意義。

本試驗擬以5種常見輔助降血脂藥物為目標，采用UPLC-MS/MS，以多反應監測模式，建立定性、定量檢測輔助降血脂保健食品中5 種降血脂藥物的方法。并對17批市售的輔助降血脂功能保健食品進行檢測，為降血脂類保健食品的安全風險監控提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

洛伐他汀、辛伐他汀、美伐他汀：規格為100 μg/mL，1 mL，美國First Standard公司；

去羥基洛伐他汀：純度為98.0%，1 mg，美國First Standard公司；

洛伐他汀羥酸鈉鹽：純度為95.2%，10 mg，美國First Standard公司；

甲醇、乙腈：HPLC級，美國Merck公司；

17種輔助降血脂保健食品：市售。

1.2 儀器與設備

液質聯用儀：Waters TQD型，美國Waters公司；

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3型，50 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國Waters公司；

超純水器：Milli-Q型，法國密理博公司；

孔徑濾膜：0.22 μm，天津市津騰實驗設備有限公司；

渦旋振蕩器：Talboys型，上海安譜實驗科技股份有限公司；

高速離心機：Avanti JXN-30型，美國Beckman Coulter公司；

電子天平：ME204型，梅特勒-托利多儀器有限公司；

數控超聲波清洗器：S 180H型，德國Elma公司。

1.3 方法

1.3.1 相關溶液的配制 分別精密量取800 μL濃度為100 μg/mL 的洛伐他汀、辛伐他汀、美伐他汀于10 mL容量瓶，用甲醇稀釋并定容至10 mL，配制濃度為8 μg/mL的單標溶液。用甲醇溶解1 mg去羥基洛伐他汀，并轉移到10 mL 容量瓶，定容，配制濃度為100 μg/mL標準溶液；稱取洛伐他汀羥酸鈉鹽4 mg，用甲醇溶解，并定容到10 mL，配制濃度為400 μg/mL標準溶液。標準工作液根據需要稀釋。

1.3.2 樣品前處理 參考《國食藥監辦許[2010]114號》[8]的前處理方法并加以改進。油狀膠囊：刺破膠囊，將內容物擠出，混勻。口服溶液：取同一批次口服液混勻。固體顆劑：用研缽將片劑研磨成粉狀，混勻。精密稱取混勻的樣品1.0 g，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇約40 mL，混勻，超聲處理(功率800 W，頻率 37 kHz)30 min，取出，放冷，用甲醇定容到刻度，取續濾液，過0.22 μm 濾膜，備用。

空白基質：精密稱取空白樣品適量，使用與樣品同樣的前處理方式，得到空白基質。

1.3.3 超高效液相色譜條件 采用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)為固定相；流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸水溶液，洗脫梯度為：0.0～0.5 min，B相保持90%，0.5～1.5 min，B相 90%～5%，1.5～3.0 min，B相保持5%，3.0～3.1 min，B相5%～90%，3.1～5.0 min，B相90%。柱溫35 ℃；進樣量5 μL；流速0.3 mL/min。

1.3.4 質譜條件 離子源：電噴霧離子源；掃描模式：正負離子同時掃描；毛細管電壓：3 000(ESI+)，-2 500 V(ESI-)；源溫度：150 ℃；脫溶劑溫度：350 ℃；脫溶劑氣流速：800 L/h；錐孔氣流量：50 L/h；采集模式：多反應監測(MRM)。各化合物的質譜參數見表1。

表1 5種化合物的質譜參數?

? *. 定量離子。

2 結果與討論

2.1 質譜條件優化

采用蠕動泵分別將濃度為 1 μg/mL的5種標準品注入離子源，在全掃描模式下分別對5種化合物進行一級質譜分析，發現洛伐他汀、辛伐他汀、美伐他汀、去羥基洛伐他汀采用正離子掃描模式響應高，洛伐他汀羥酸鈉鹽采用正負離子掃描響應均高，但后續試驗發現采用負離子掃描干擾小，故采用負離子掃描。分別對分子離子進行二級質譜分析，選取豐度強且干擾少的2對子離子，通過優化錐孔電壓、碰撞能量等質譜參數，使相應離子響應達到最大值，得出最佳質譜條件，見表1。

2.2 液相條件優化

流動相的組成會影響色譜峰形、分離度及靈敏度。LC-MS/MS分析中正離子模式通過添加甲酸，負離子通過添加氨水或易揮發緩沖鹽來提高離子化效率，通過改變流動相洗脫梯度來分離化合物。本試驗考察了水+乙腈、0.1% 甲酸水溶液+乙腈、水+甲醇、0.1%甲酸水+甲醇作為流動相時，5種目標化合物離子對的響應強度及色譜峰形。結果表明以0.1%甲酸水溶液+乙腈作為流動相時，5種化合物的響應最高，峰形尖銳且對稱。還考察了流速為0.2，0.3，0.4 mL/min時的色譜圖，發現0.4 mL/min時峰形最尖銳，但系統壓力高，且靈敏度低于0.3 mL/min條件下的靈敏度，因此本試驗采用0.3 mL/min流速。5種化合物的總離子流圖見圖1。

2.3 基質效應

UPLC-MS/MS是定性定量檢測保健食品中非法添加藥物的常用檢測方式，但這種檢測方式可能有基質效應，造成檢測方法不穩定，結果不準確。在實際檢測中，當基質效應為80%～120%時可忽略。本試驗研究了3種不同類型的降血脂保健食品(油狀膠囊、口服溶液、固體顆粒)的基質效應。試驗結果表明，5種化合物在3種不同基質中的基質效應均為80%～120%，基質效應可以忽略。

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性范圍、檢出限及定量限 配制一系列質量濃度的標準溶液在1.3的條件下進行測定，以響應為縱坐標，化合物質量濃度為橫坐標，繪制線性方程，得出5種物質在一定線性范圍內呈現出良好的線性關系，相關系數均>0.99，以3倍信噪比確定目標化合物的檢出限，10倍信噪比確定目標物的定量限，結果見表2。

圖1 5種化合物的總離子流圖

表2 5種化合物的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和定量限

表3 5種化合物的加標回收率及相對標準偏差

2.4.2 方法的回收率及精密度 按0.05，0.50，1.00 mg/kg 3個質量濃度水平對空白樣品進行添加回收試驗，每個添加水平平行測定6次，按照本方法進行檢測，計算平均回收率及標準偏差。結果(表3)顯示，5種化合物平均回收率為 94.6%～105.7%，相對標準偏差均<10%，該方法的回收率和相對標準偏差均具有較好的準確度和精密度，滿足分析要求。

2.5 實際樣品檢測結果

本試驗共檢測輔助降血脂類保健食品17批次。結果發現某品牌大豆磷脂膠囊檢出洛伐他汀、洛伐他汀羥酸鈉鹽、去羥基洛伐他汀，其含量分別為1 800.00，11.13，0.12 mg/kg。

3 結論

本試驗用UPLC-MS/MS同時測定保健食品中5種洛伐他汀及其類似物，方法簡便、快速，系統的方法學評價結果表明該方法操作簡便、回收率好、靈敏度高、定量準確，能滿足降血脂類保健食品中洛伐他汀及其類似物的測定要求。但本試驗沒有對臨床上常用的其它他汀類物質同時檢測，今后可以進一步對保健食品中風險較大的他汀類物質進行UPLC-MS/MS檢測。