海藻酸鈉沒食子酸衍生物的制備及性能分析

楊潔鈺 曾凡坤 鐘金鋒 覃小麗

(西南大學食品科學學院，重慶 400715)

海藻酸鈉(sodium alginate，SA)主要從褐藻、海帶中分離得到，是一種由α-L古羅糖醛酸和β-D甘露糖醛酸連接起來的天然多糖，具有良好的生物相容性和降解性[1]，常用作新鮮農產品的初步涂膜保鮮和復合膜封裝保鮮，同時，也可作為食品增稠劑及部分食品營養因子的載體[2-3]，是一種非常有前景的多糖，但SA性能單一，在食品領域的應用存在一定的局限性。沒食子酸(gallic acid，GA)是一種典型的酚類物質，具有多種有價值的生物活性，其結構中含有3個酚羥基，表現出強抗氧化[4-5]、抑菌[6]、抗炎、抗癌[7-8]等特性。因此，研究SA的衍生化產物，賦予其新的性能，對拓展SA在食品領域應用具有重要指導意義。

目前，已有通過碳化二亞胺基化學偶聯法、酶催化法、自由基引發法將GA、咖啡酸和阿魏酸等酚酸接枝到殼聚糖上[9-10]，自由基引發法將兒茶素接枝到SA上等接枝改性多糖及其相關性能的研究報道[11]，接枝改性后的多糖理化性質和生物活性得到改善，具有更好的水溶性、抗氧化性和抑菌性等，現已有殼聚糖沒食子酸衍生物應用于鮮切蘋果、銀鯧魚保鮮的研究[12-13]，但關于海藻酸鈉接枝沒食子酸衍生物的性能及其應用還未見系統報道。因此，本試驗擬采用自由基引發法，以抗壞血酸、過氧化氫為自由基引發劑，制備海藻酸鈉—沒食子酸衍生物(sodium alginate-gallic acid derivative，GA-SA)，探索自由基引發劑添加總量對接枝度的影響，對GA-SA性能進行分析并研究其對車厘子的保鮮效果，為GA-SA在食品涂膜保鮮上的應用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海藻酸鈉(純度≥98.0%)、沒食子酸(純度≥98.5%)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)：南京都萊生物技術有限公司；

車厘子：市購；

Folin-Ciocalteu：北京索萊寶科技有限公司；

溴化鉀：光譜純，天津市光復精細化工研究所；

30%過氧化氫溶液：分析純，成都金山化學試劑有限公司；

抗壞血酸：分析純，廣東省化學試劑工程技術研究開發中心；

碳酸鈉：分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 試驗儀器

冷凍干燥機：FD-1A-50型，北京博醫康實驗儀器有限公司；

紫外可見分光光度計：UV-6100型，上海元儀器有限公司；

鎢燈絲掃描電子顯微鏡：JSM-6510LV10800型，日本JEOL公司；

紅外光譜：Spectrum 100型，美國PerkinElmer公司；

拉曼光譜儀：DXR2型，美國Thermo Fisher Scientific公司；

差示掃描量熱儀：DSC4000型，美國PerkinElmer公司；

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S型，鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 GA-SA的制備 參考文獻[14]的方法，修改如下：在250 mL三口燒瓶中，取1.0 g SA溶于100 mL超純水，30 ℃水浴加熱并攪拌使SA完全溶解。通氮氣5 min 以除去氧氣，保持過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)和抗壞血酸(ascorbic acid，AA)的摩爾比(3.5∶1.0)不變，添加不同量的H2O2和AA，然后繼續通氮氣并攪拌30 min，加入1.0 g GA，反應溫度25 ℃磁力攪拌24 h。根據文獻[14]的透析方法進行透析，以去掉游離的GA，將混合物倒入透析袋(MWCO 3 500 Da)中，用去離子水長時間透析，每8 h更換一次去離子水。透析結束后，經真空冷凍干燥后得到最終產物，密封袋封裝。對照樣除不添加GA外，其他操作同上。

1.3.2 GA-SA接枝度的測定 根據文獻[15]報道的Folin-Ciocalteu法，修改如下：準確配制3 mg/mL的GA-SA溶液，取2 mL該溶液與1 mL Folin-Ciocalteu試劑(10倍稀釋)于10 mL容量瓶中，避光靜置5 min后，加入15% Na2CO3溶液2 mL，去離子水定容并搖勻，25 ℃避光靜置2 h，紫外可見分光光度計750 nm波長處測定其吸光度。以相同的方式制備不同濃度的GA標準品，繪制GA的標準曲線。GA-SA的接枝度表示為每克GA-SA含有的GA的毫克量，按式(1)計算：

(1)

式中：

DG——接枝度，mg/g；

m1——GA-SA中GA質量，mg；

m2——GA-SA質量，g。

1.3.3 GA-SA的性能分析

(1) 傅里葉紅外光譜：采用溴化鉀壓片法[14]。

(2) 拉曼光譜：將樣品均勻地鋪在單凹載玻片的凹部，用MPlan 20×/0.40物鏡觀察，選取成像清晰典型的區域進行拉曼激光散射。測量拉曼光譜范圍3 378～50 cm-1，曝光時間10 s，曝光30次。光闌選用50 μm狹縫，激光波長785 nm，激光能量30.0 mW，采用拉曼光譜儀自帶的操作軟件采集及處理拉曼圖譜。

(3) 差示掃描量熱分析：使用差示掃描量熱儀進行測試將樣品置于PE鋁盤內，蓋上鋁蓋，固態壓片機密封鋁盒，熱分析從25 ℃升到400 ℃，加熱速率10 ℃/min，氮氣作為吹掃氣和保護氣，空白鋁盒作為對照。

(4) 掃描電子顯微鏡觀察：采用掃描電鏡系統檢測SA和GA-SA的微觀表面形態特征變化。將樣品固定在樣品架上并噴射一層薄金，高真空條件及20 kV的加速電壓下進行SEM檢測并選取具有代表性的區域拍攝，放大倍數為200倍和1 000倍。

(5) GA-SA的抗氧化活性測定：根據文獻[11,16]中的測定方法，修改如下：取5 mL不同濃度的GA-SA溶液和5 mL 無水乙醇配制的80 μg/mL DPPH自由基溶液于具塞試管中，搖勻后25 ℃避光靜置3 h，紫外可見分光光度計517 nm 處測吸光度，按式(2)計算清除率。同時測定SA和GA對DPPH自由基的清除率。

(2)

式中：

R——清除率，%；

A1——待測液與DPPH自由基溶液吸光度值；

A0——5 mL DPPH自由基溶液與5 mL去離子水的吸光度；

A2——5 mL待測液與5 mL無水乙醇的吸光度。

1.3.4 GA-SA對車厘子保鮮作用研究 挑選色澤紅潤，大小均勻，無腐爛無損傷新鮮的車厘子果實，分為3組，每組15個。將各組車厘子分別置于濃度為10 mg/mL GA-SA溶液、SA溶液中浸泡10 min，以去離子水浸泡10 min 的車厘子作為空白對照組，瀝干、放在紙盤中，并用紙盤蓋好，置陰涼通風處放置。每天觀察稱重并拍照記錄，按式(3)計算車厘子的質量損失。

(3)

式中：

WR——車厘子質量損失率，%；

m0——貯藏前果實質量，g；

m1——貯藏后果實質量，g。

車厘子的腐爛率按式(4)計算：

(4)

式中：

DR——車厘子腐爛率，%；

N0——果實總個數；

N1——腐爛果實個數。

1.4 數據處理

各試驗重復2次，各樣品的指標平行測定3次，結果以平均值±標準偏差表示。使用SPSS 22.0軟件對數據進行單因素方差分析(P<0.05時判斷組間存在顯著差異)，用Origin 8.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 GA-SA的接枝度

Liu等[17-18]研究發現H2O2和AA添加量會影響最終的多糖分子自由基產生量，進而影響衍生物最終的接枝度，說明H2O2和AA的添加量對接枝度有重要影響。本研究固定H2O2和AA的添加比例，考察不同添加量H2O2和AA對GA-SA接枝度的影響。由圖1可知，隨著自由基引發劑添加量增多，接枝度先增高后降低。當自由基引發劑添加量為5.54 mmol時，接枝度最高，可能是隨著H2O2和AA添加量增多， 產生的羥基自由基和抗壞血酸自由基增多，促使GA與SA接枝反應機率升高，所以接枝度升高。然而，自由基引發劑添加量繼續增多(≥8.31 mmol)時，接枝度呈下降趨勢，可能是產生的羥基自由基和抗壞血酸自由基過多，且二者之間發生反應最終使AA降解為脫氫抗壞血酸[17]，產生的自由基因此而減少，導致SA與GA的接枝反應程度降低。綜上所述，當固定H2O2和AA摩爾比為3.5∶1.0，添加H2O2和AA 5.54 mmol時，得到最高的接枝度(4.260 mg/g)。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 GA-SA的性能分析

2.2.1 傅里葉紅外光譜 圖2是SA、GA、GA和SA的物理共混物和GA-SA(接枝度4.260 mg/g)的傅里葉紅外光譜。SA和GA在3 400～3 200 cm-1波數處均有強而寬的吸收峰，這是由分子內或分子間O—H伸縮振動引起；SA在3 020 cm-1波數處和GA在2 930 cm-1波數處的吸收峰均是C—H伸縮振動峰；可見在3 400～2 900 cm-1的O—H和C—H伸縮非2種物質的特征結構[19]。SA是一種多糖，其特征峰包括在1 596，1 404 cm-1附近的COO—對稱和不對稱伸縮振動吸收峰；在1 150 cm-1波數處糖結構中吡喃糖環C—O—C橋的不對稱伸縮振動吸收峰；以及在1 060，1 024，900 cm-1波數處的C—C和C—O伸縮振動吸收峰[19-21]。GA是一種苯酚，其主要特征峰是1 028 cm-1波數處的苯環振動吸收峰[19]。以上SA與GA的特征峰在GA和SA的物理共混物的紅外光譜中均可見，而GA-SA的紅外光譜與SA和GA的都不同，說明GA-SA中2物質非簡單疊加，而是存在強的相互作用。其中GA和SA的物理共混物、GA在1 700 cm-1波數處的吸收峰，是由GA中的羧基振動引起，而此峰在GA-SA紅外光譜中未出現，說明GA中的羧基全部參與了接枝反應；此外，相比SA，GA-SA在1 735 cm-1波數處可觀察到一個新的吸收峰，它是由酯基振動引起，表明GA與SA發生了酯化反應，GA與SA之間形成酯鍵，GA已有效接枝到SA上，與Hu等[14]報道的殼聚糖沒食子酸衍生物出現酯鍵類似。

圖2 SA、GA、GA和SA物理共混物和GA-SA

Figure 2 Infrared spectra of SA, GA, GA and SA physical mixture and GA-SA(grafting degree 4.260 mg/g)

2.2.2 拉曼光譜 圖3是GA、GA-SA(接枝度4.260 mg/g)和SA的拉曼光譜。SA中特征峰包括1 612 cm-1和1 415 cm-1附近的COO-不對稱和對稱伸縮振動吸收峰；1 200～900 cm-1的C—O—H變形、C—O和C—C伸縮振動吸收峰；700 cm-1處及以下糖結構中的吡喃糖環變形和C—O—C糖苷鍵振動吸收峰[22-23]。GA的特征峰包括1 691 cm-1處C—O伸縮振動吸收峰，1 621 cm-1處芳環的C—C伸縮振動吸收峰，1 399～1 300 cm-1處C—H基團拉伸和—OH彎曲振動吸收峰，以及200 cm-1以下由GA中的晶格振動引起的強烈吸收峰[24]。GA-SA與SA拉曼光譜差異不明顯，GA中的特征峰并非都在GA-SA中出現，說明GA與SA之間有較強的相互作用。相比SA，GA-SA在1 726 cm-1處出現新的吸收峰，它是拉曼光譜中代表酯基的特征峰，表明GA與SA發生酯化反應形成了酯鍵，GA接枝到了SA上，與Cadilia等[25]報道的海藻酸鈉殼聚糖微膠囊中出現的酯鍵類似。

圖3 GA、GA-SA(接枝度4.260 mg/g)和SA拉曼光譜

2.2.3 差示掃描量熱分析 由圖4可看出，GA-SA(接枝度4.260 mg/g)與SA的熱分析圖差異明顯。SA在98 ℃出現吸熱峰，而GA-SA的吸熱峰降低到82 ℃，該吸熱峰是因為多糖主鏈中水分的損失。通常，與水分蒸發相關的吸熱現象可一定程度反映接枝過程中的物理和分子變化；GA-SA的吸熱峰溫度降低，可能是GA進入SA骨架導致其保水能力下降所致。SA在295，322 ℃附近出現2個小的放熱峰，GA-SA僅在322 ℃附近有一個寬而明顯的放熱峰，該放熱峰是由多糖鏈的降解引起[26]。GA-SA的降解溫度升高表明其熱穩定性升高；放熱峰的變化可能是GA接枝在SA上，使SA鏈上增加了新的基團，對衍生物的分子結構和分子排列產生影響[11]。

圖4 SA和GA-SA(接枝度4.260 mg/g)的DSC熱分析圖

Figure 4 DSC thermal analysis of SA and GA-SA(grafting degree 4.260 mg/g)

2.2.4 掃描電子顯微鏡觀察 在掃描電鏡下觀察冷凍干燥的SA和GA-SA(接枝度4.260 mg/g)的表面形態，可以看到明顯的差異。由圖5可知，真空冷凍干燥的SA呈薄片狀且表面平滑，片塊連續均勻，邊緣較為光滑，結構致密，可能是SA中存在強的分子間和分子內氫鍵[14]。冷凍干燥后的GA-SA與SA相比，并非呈連續致密的光滑薄片狀，其均勻性較差，結構較為松散，表面粗糙并出現明顯空隙，有較為明顯的顆粒狀物質，邊緣呈鋸齒狀，可能是接枝改性后GA-SA短鏈較多，分子間氫鍵減少，分子間作用不強，不易形成緊密網絡結構，因而呈現出粗糙的表面結構[19]；也可能是GA-SA比SA具有更好的溶解性和較小的黏度。

A. a分別是 SA放大200，1 000倍 B. b分別是 GA-SA放大200，1 000 倍

圖5 SA和GA-SA(接枝度4.260 mg/g)的掃描電鏡圖

Figure 5 SEM images of SA and GA-SA(grafting degree 4.260 mg/g)

2.2.5 GA-SA的抗氧化活性 圖6是不同質量濃度的GA、GA-SA(接枝度4.260 mg/g)和SA對DPPH自由基的清除率。當SA濃度在0.25～4.00 mg/mL時，SA對DPPH自由基清除率始終不超過5.2%；清除率不隨SA濃度增加而增加，表明SA的抗氧化性極低，可能是SA分子間和分子內氫鍵 網絡結構及較差的供氫能力抑制了對自由基的清除能力[27-28]。GA作為一種天然抗氧化劑分子，在濃度低至0.25 mg/mL 時仍然有較高的DPPH自由基清除率，且明顯高于GA-SA和SA。隨著濃度的增加，GA-SA對DPPH自由基的清除率逐漸增加，當濃度達到4 mg/mL時，清除率達到92.0%，接近GA的清除率(95.0%)，表明GA與SA接枝極大地提高了GA-SA的DPPH自由基清除活性，可能是改性后GA-SA的活性羥基增多，能提供更多質子與DPPH自由基結合生成穩態的DPPH2，進而有效地清除DPPH自由基[28]。圖7是添加不同量H2O2和AA時，GA-SA的接枝度及其對DPPH自由基的清除率(GA-SA濃度均為1 mg/mL)，GA-SA接枝度為2.905，4.260，3.290，3.083 mg/g 時，DPPH清除率分別為60.59%，76.04%，68.00%，65.10%，且清除率存在顯著差異，表明SA鏈上的GA在GA-SA的抗氧化活性中起著至關重要的作用。

2.3 GA-SA對車厘子的保鮮作用

車厘子是一種營養價值較高的鮮食水果，但其皮較薄，耐貯穩定性差，易敗壞，因此，本研究擬探索SA衍生物對車厘子貯藏過程中的保鮮效果。車厘子貯藏過程中的質量損失率和果實腐敗率是檢驗其是否耐貯藏的重要指標[29]。圖8 是空白組、SA組和GA-SA(接枝度4.260 mg/g)組車厘子貯藏過程果實腐爛率折線圖。隨著貯藏時間的延長，各組車厘子的腐爛率均呈逐漸上升趨勢。與空白組和SA組相比，GA-SA組車厘子腐爛率明顯較低?？瞻捉M和SA組貯藏3 d以上腐爛率均急劇上升，而GA-SA組腐爛率上升緩慢。第6天時，空白組和SA組腐爛率已有20.00%，而GA-SA組腐爛率仍為0%。第12天時，空白組腐爛率76.67%，SA組腐爛率53.33%，GA-SA組腐爛率20.00%。相比于SA，GA-SA的抗氧化性和抑菌性均有所提高，可能是GA-SA 中的酚類物質起到了作用，在車厘子果實表面形成一層抗氧化且抑菌的保護膜，避免了空氣中氧氣的氧化作用和微生物的入侵。圖9是空白組、SA組和GA-SA組的果實質量損失率折線圖。隨著貯藏時間的延長，3組果實均有質量的損失，但GA-SA組的車厘子質量損失率明顯低于空白組和SA組。從第6天開始，空白組、SA組和GA-SA組的質量損失率分別為18.74%，14.95%，10.77%，3組的質量損失率存在顯著差異；表明GA-SA涂膜處理可有效地減少車厘子在貯藏期間的水分散失，大大降低其質量損失率。結果表明GA-SA涂膜處理對車厘子具有較好的保鮮效果，能有效保持車厘子果實的新鮮度，延緩果實腐敗變質和水分散失。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Figure 7 Effect of H2O2and AA addition on GA-SA grafting degree and scavenging DPPH free radical

圖8 不同處理對車厘子腐爛率的影響

圖9 SA和GA-SA(接枝度4.260 mg/g)對車厘子質量

Figure 9 Effect of SA and GA-SA(grafting degree 4.260 mg/g)on the weight loss rate of cherries

3 結論

本研究采用H2O2-AA自由基引發接枝的方法，合成GA-SA。自由基引發劑H2O2和AA最適添加量為5.54 mmol，此時接枝度為4.260 mg/g。GA-SA的紅外光譜和拉曼光譜中均有酯基特征峰出現，表明GA與SA通過酯化反應接枝；接枝后GA-SA熱穩定性、分子結構和分子排列產生變化，其抗氧化活性明顯高于SA。應用研究表明，GA-SA對車厘子的涂膜保鮮效果良好。綜上所述，GA-SA有較好的抗氧化、抑菌性，可作為一些食品的涂膜保鮮材料。本試驗對GA-SA的合成、性能及在鮮果保鮮中的應用進行了研究，其工藝優化及對鮮果品質的影響有待進一步探索。