朝鮮薊中2種木犀草素類化合物液相制備條件優化

師明月曹清明李 群鐘文惠王元清劉志文張喜平

(1. 中南林業科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004；2. 匯美農業科技有限公司， 湖南 常德 415137；3. 常德市農林科學研究院，湖南 常德 415000)

朝鮮薊是一種高營養價值的保健蔬菜[1-2]，被譽為“蔬菜之皇”[3-4]，其提取物一直用于民間醫藥[5]，在各種藥理試驗中表現出促進消化[6]、保肝[7]、利膽[8]、抗癌[9]以及抑制低密度脂蛋白氧化[10]的能力。臨床試驗表明，朝鮮薊具有降低血漿膽固醇[11-12]、降低腸易激綜合征[13]、減肥[14]以及控制空腹血糖升高[15]等功效。

朝鮮薊的次生代謝產物主要是多酚類化合物[16-18]和具有苦味的愈創木烷倍半萜內酯類化合物。多酚類化合物表現出抗氧化能力等活性，愈創木烷倍半萜內酯表現出抗炎及抑制腫瘤等多種功效[19-20]。

Pandino等[21]報道了6個品種朝鮮薊的3個部位(包括花托、外苞片和內苞片)的多酚含量，研究結果表明木犀草素糖苷類化合物含量為24(Tema 2000品種的外苞片)～620 mg/kg(Tondo di Paestum品種的花托)，其含量比咖啡酰奎寧酸類化合物含量[23(Tema 2000品種的內苞片)～5 771 mg/kg(Violetto di Sicilia品種的內苞片)]和芹菜素含量[870(Blanc Hyerois品種的內苞片)～5 397 mg/kg(Tema 2000品種的花托)]低。木犀草素(luteolin)類化合物含量雖低于其他2類酚類化合物，但由于其B環具有鄰二酚羥基結構，表現出強抗氧化活性、抑制膽固醇合成、抑制糖尿病以及抗腫瘤活性等功效。Schlupper等[22]研究木犀草素及其衍生物的活性發現，木犀草素、木犀草素7-O-糖苷在極低濃度下表現出明顯的抗氧化能力；Gebhardt[23]研究表明木犀草素類化合物的木犀草素配苷主要負責抑制肝臟膽固醇的生物合成，而綠原酸、咖啡酸、洋薊素和其他二咖啡酰奎寧酸無顯著影響；且木犀草素亦能有效阻斷胰島素對膽固醇生物合成的影響，從而驗證了朝鮮薊的降血脂作用。木犀草素對表皮生長因子受體—酪氨酸激酶(EGFR-TK)具有明顯抑制作用。Rahimuddin等[24]研究發現木犀草素及其糖苷對UVA導致的皮膚成纖維細胞脂質過氧化具有抑制作用。

目前，中國種植的朝鮮薊品種主要有：改良綠球、綠寶石、帝王之星、A106、A109、洛爾卡和上海朝鮮薊等[25]。洛爾卡(Lorca)是常德市于2005年從法國引進的一個加工型朝鮮薊新品種，并通過常德市農業科學研究所、匯美農業科技有限公司選育，經過多年試驗與示范，目前已成為湖南省的主要栽培品種[26]。課題組擬以洛爾卡朝鮮薊作為研究對象，開發木犀草素類化合物的分離純化新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

朝鮮薊(CynarascolymusL.)花苞：洛爾卡(Lorca)品種，常德匯美農業科技有限公司提供。

大孔樹脂：AB-8型，安徽三星樹脂科技有限公司；

木犀草苷-7-β-D-蕓香糖苷標準品：HPLC純，純度≥98.0%，美國Sigma-Aldrich公司；

木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷標準品：HPLC純，純度≥98.0%，美國Sigma-Aldrich公司；

氘代試劑CH3OD：氘代率≥99.8%，美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

RP-C18層析柱：Sepax GP-C18型，粒徑40～60 μm，蘇州賽分科技有限公司；

Sepax GP-C18柱：4.6 mm×150 mm，40～60 μm，自制；

Venusil MP C18柱：4.6 mm×250 mm，5 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司；

Venusil MP C18柱：10 mm×250 mm，5 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司；

Unitary C18柱：4.6 mm×250 mm，5 μm，華譜新創科技有限公司；

高效液相色譜儀：LC3000型(配備Newstyle NU3000 Serials UV/VIS檢測器)，北京創新恒通科技有限公司；

高效液相色譜:2695-2996型，美國Waters公司；

質譜儀：UHPLC-QTOF/1290-6530型，美國安捷倫科技有限公司；

核磁共振儀：Bruker AVANCE-500MHz型，德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 朝鮮薊粗提液的制備 將朝鮮薊曬干，粉碎，得到1.1 kg朝鮮薊粉末。在室溫下，將1.1 kg朝鮮薊粉末按料液比1∶10(g/mL)的比例，用70%乙醇浸提72 h。過濾，得到2 L粗提液。

1.3.2 液相色譜條件 對朝鮮薊粗提液進行液相條件摸索：進樣量20 μL，流動相為甲醇-0.1%甲酸水，流速1 mL/min，檢測波長205 nm時，峰的數量較多，為朝鮮薊提取液分析的較好條件，如無另外說明，將采納該條件。

1.3.3 AB-8型大孔樹脂對提取物進行粗分 采用大孔樹脂吸附法(AB-8型)對朝鮮薊粗提液(1 L)進行分離純化。具體步驟：將1 L柱體積的大孔樹脂顆粒進行預處理后裝柱，用水沖至無醇味，上樣過程中，接收流出液進行液相色譜檢測(分析上樣量是否超載)，洗脫梯度為0～30 min，流動相A由5%增至100%。待樣品完全吸附后，依次用水，20%，50%，80%乙醇進行洗脫，洗脫至無色或顏色較淺，將接收的流出液依次編號為：A1、A2、A3……，經高效液相色譜檢測進行合并，洗脫梯度為0～30 min，流動相A由5%增至100%。

1.3.4 RP-C18對A27～29組分進行細分 用Sepax GP-C18填料(40～60 μm)自制液相柱優化洗脫程序，以確定RP-C18層析柱的洗脫程序。將4 g冷凍干燥樣品(A27～29組分)用50%甲醇完全溶解，濃度為40 mg/mL。根據分離度選擇優化洗脫條件。將液相優化程序用于柱層析洗脫程序。將接收的流出液依次編號為：C1、C2、C3……。

1.3.5 組分C16～19的液相半制備 由于半制備時液相色譜采用的色譜柱的靈敏度和分離度都較低，故在進行液相半制備之前，需對半制備條件進行摸索。試驗以分離度和峰型為優化目的，設置了5種流動相組成(體積比)，流動相1、流動相2、流動相3、流動相4和流動相5分別為60∶40的甲醇-0.1%甲酸水、45∶55的甲醇-0.1% 甲酸水、40∶60的乙腈-0.1%甲酸水、30∶70的乙腈-0.1%甲酸水、23∶77的乙腈-0.1%甲酸水，比較分析以獲得最佳流動相分析條件。待條件優化后，采用Venusil MP C18(10 mm×250 mm，5 μm)半制備柱，流速增至3 mL/min進行放大制備。為避免樣品浪費，縮短制備時間，還需確定進樣量，試驗設置了30，50 μL進樣量進行研究。

1.3.6 質譜條件

(1) 質譜工作站軟件：Agilent MassHunter B.06.00版。色譜工作站軟件：Agilent 1200化學工作站。

(2) LC-MS工作條件：Unitary C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，洗脫劑乙腈—水(體積比25∶75)，進樣量2 μL，檢測波長254 nm；電噴霧離子源，正、負離子檢測。

1.3.7 核磁共振檢測條件 溶劑為CH3OD，NMR的工作頻率分別為1H譜500 MHz，13C譜為125 MHz。1H-NMR 譜采樣脈沖寬度90°，累加32次；13C-NMR譜采樣脈沖寬度90°，累加2 000次。

2 結果與分析

2.1 AB-8型大孔樹脂對樣品進行粗分

根據HPLC圖的峰型和出峰時間進行合并，A27～29組分出峰相對簡單(如圖 1所示)，3個組分出峰相似，合并，濃縮，冷凍干燥，得到4 g目標組分A27～29。

2.2 RP-C18對A27～29組分進行細分

優化的洗脫條件見表1，此條件下分離效果較好。將此條件用于A27～29組分的洗脫，即：依次用30%，48%，100%甲醇進行洗脫。通過計算，30%甲醇用量為6 L，48%甲醇用量為4 L，100%甲醇用量為2 L。根據液相檢測結果合并為C1、C2～4、C5～10、C11～15、C16～19……，分別減壓濃縮，冷凍干燥，得到C16～19組分0.32 g。圖2中，組分C16～19出峰較為簡單，能夠分離出純化合物，考慮對C16～19組分進行液相半制備。

圖1 A29組分的HPLC分析圖

表1 HPLC洗脫程序

圖2 C16～19組分的HPLC分析圖

2.3 組分C16～19的液相半制備

2.3.1 液相條件的優化

(1) 流動相的優化：對5個不同流動相進行比較，得到乙腈∶0.1%甲酸水(體積比)=23∶77(流動相5)為最優流動相。

由圖3(a)可知，在流動相1條件下，甲醇濃度為60%，由于甲醇濃度過高，造成各峰一起被洗脫，且未達到基線分離，故需要降低甲醇濃度。圖3(b)中，在流動相2條件下，降低甲醇濃度，分離效果仍不太理想，故改用乙腈作為流動相，40%乙腈濃度(流動相3)色譜圖如3(c)，峰一下被洗脫，需降低乙腈濃度，故改用流動相4(30%乙腈)，出峰如圖3(d)，各峰集中，較快被洗脫，說明30%乙腈濃度過高，將乙腈濃度降低到23%(流動相5)，如圖3(e)所示，各峰的分離效果比較好。故優化的液相分析條件：流動相A為乙腈(23%)，B為0.1%甲酸水(77%)；優化的洗脫條件見表2。

(2) 分離度比較：為判斷物質在色譜柱中的分離情況，常用分離度作為柱的總分離效能指標，分離度越大則表明物質在色譜柱中的分離效果越好。對上述的5種不同的流動相分析條件所得的圖譜進行分離度比較(以色譜圖中第一、第二2個峰之間的分離度計算)，結果如表3所示。

從圖2(e)、表3可知，在乙腈∶0.1%甲酸水為23 ∶77(體積比)的條件下，分離度較大，分離效果最好，且峰形尖銳，保留時間合適，對環境有害的有機相使用比例更少。

圖3 C16～19組分在5種不同流動相下的HPLC分析圖

表2 優化的C16～19組分HPLC洗脫程序

表3 5種分離條件下的分離度

(3) 制備條件的確定：利用上述優化的條件，除將柱子改為半制備柱[Venusil MP C18(10 mm×250 mm，5 μm)，流速改為3 mL/min]外，其他條件不變，即洗脫程序為表2所示。將C16～19組分用23%乙腈溶解，分別對進樣量30，50 μL進行優化，所得制備圖(50 μL進樣量色譜見圖4)差異較小，為節省溶劑，縮短試驗時間及損耗，本試驗選擇進樣量為50 μL。

圖4 C16～19組分的HPLC半制備圖(50 μL)

綜上所述，半制備條件為：流速3 mL/min，進樣量50 μL，流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸水，洗脫程序如表2所示(40 min后的梯度為沖洗色譜柱)。

2.3.2 液相半制備 將0.32 g C16～19組分用23%乙腈溶解，濃度為200 mg/mL，按優化的條件制備。如圖4所示，峰I、II分離效果較好，分別收集峰I、II。將收集液減壓濃縮，冷凍干燥后，稱重，液相色譜測定純度，并得到純度較高的2個化合物，記為H-01、H-02，其質量分別為30，15 mg，提取得率分別為54.5，27.3 mg/kg，純度分別為97.8%，96.5%。2個樣品純度均符合核磁檢測條件。

2.4 化合物的結構解析

2.4.1 H-01 ESI-MS給出：正離子模式下，質譜數據m/z595.165 7[M+H]+；負離子模式下，質譜數據m/z593.149 2[M-H]-，推測其分子式為C27H30O15。1H-NMR：6.52(1H，s，H-3)， 6.46(1H，d，J=2 Hz，H-6)，6.63(1H，d，J=2 Hz，H-8)，7.33(2H，m，H-2′，6′)，6.88(1H，s，H-5′)，5.00(1H，m，H-1″)，3.64(1H，m，H-6″a)，4.05(1H，d，J=9.7 Hz，H-6″b)，4.73(1H，s，H-1?)，3.93(1H，s，H-2?)，3.76(1H，d，J=9.4 Hz，H-3?)，1.20(3H，d，J=5.8 Hz，H-6?)。13C-NMR：166.73(C-2)， 104.14(C-3)，183.85(C-4)，162.76(C-5)，101.07(C-6)，164.57(C-7)，96.16(C-8)， 158.67(C-9)，107.00(C-10)，123.37(C-1′)，116.85(C-2′)，146.84(C-3′)，151.06(C-4′)，114.29(C-5′)，120.62(C-6′)，102.05(C-1″)，74.71(C-2″)，77.73(C-3″)，71.31(C-4″)，77.09(C-5″)，67.47(C-6″)，101.54(C-1?)，72.37(C-2?)，72.03(C-3?)，74.03(C-4?)，69.77(C-5?)，17.91(C-6?)。

綜合所有核磁譜圖及質譜結果，H-01鑒定為Luteolin 7-O-α-L-Rhamnosyl(1-6)-β-D-Glucoside(木犀草素7-O-α-L-鼠李糖(1-6)-β-D-葡萄糖苷)，將其1H-NMR、13C-NMR以及質譜數據與文獻[27]報道的化合物3對照，基本一致。

2.4.2 H-02 質譜數據m/z449.109 4[M+H]+、碎片離子287.057 5+，推測其分子式為C21H20O11，含有一個黃酮骨架和一個葡萄糖糖苷。1H-NMR：6.56(1H，s，H-3)，6.45(1H，s，H-6)，6.74(1H，s，H-8)，7.37(1H，s，H-2′)，6.89(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，7.38(1H，d，J=8.0 Hz，H-6′)，5.07(1H，d，J=7.0 Hz，H-1″)， 3.50～3.60(2H，m，H-2″，H-3″)，3.40(1H，m，H-5″)，3.96(1H，d，J=12.2 Hz，H-6″a)，3.72-3.75 (1H，dd，J=12.2，5.6 Hz，H-6″b)。13C-NMR：166.82(C-2)，107.08(C-3)，183.99(C-4)，164.74(C-5)，101.16(C-6),，162.82(C-7)，96.07(C-8)，158.93(C-9)，104.18(C-10)，123.48(C-1′)，114.31(C-2′)，147.03(C-3′)，151.16(C-4′)，116.80(C-5′)，120.53(C-6′)，101.64(C-1″)，74.75(C-2″)，77.86(C-3″)，71.29(C-4″)，78.39(C-5″)，62.49(C-6″)。

綜合所有核磁譜圖及質譜結果，H-02鑒定為Luteolin 7-O-β-D-Glucoside(木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷)，將其1H-NMR、13C-NMR及質譜數據與文獻[28]報道的化合物1對照，基本一致。

2.5 C16～19組分中木犀草素含量的確定

采用表2優化的液相條件，將木犀草苷-7-蕓香糖苷和木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷標準樣品分別用乙腈溶解，進行液相分析。采用外標法，對C16～19組分中的木犀草苷-7-蕓香糖苷和木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷進行定量，結果表明，2個化合物在C16～19流分中的含量分別為10.4%，5.1%，C16～19流分中H-01和H-02制備的得率分別為90.1%，91.9%，說明該液相制備方法的優化合理，可應用于類似組分的分離制備。

3 結論

本研究以洛爾卡(Lorca)為研究對象，開發了木犀草素類化合物的分離純化新方法，得到純度分別為97.8%和96.5%的木犀草苷-7-蕓香糖苷和木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷，其總提取得率分別為54.5，27.3 mg/kg，與Pandino等[21]研究的朝鮮薊相比，本試驗中所采集的樣品木犀草素類化合物含量中等，若能選擇木犀草素類化合物含量高的樣品，可制備更多的純品。木犀草素糖苷由于B環具有3’，4’鄰二酚羥基結構，其具有較強的抗氧化功能，分離和純化木犀草素糖苷具有非常重要的意義。