女貞子總黃酮超聲輔助提取工藝及體外抗氧化活性研究

周 旋 許明祥 蔡文卓 翟曉瑞 霍明洋 高 銳 郗艷麗

(吉林醫藥學院公共衛生學院，吉林 吉林 132013)

女貞子(FructusLigustriLucidi)為木犀科植物女貞的干燥成熟果實，又名冬青子、女貞實等[1]。女貞子是中國傳統中藥，始載于《神農本草經》，歷代本草及《中國藥典》(1963～2015版)均有記載[2]。現代研究發現，女貞子中主要含有黃酮類、萜類、多糖類及揮發油等化學成分[3]，女貞子黃酮是女貞屬植物中常見的化學成分，具有降血脂[4]、抗菌[5]、抗氧化[6]等功效。

目前、植物黃酮的主要提取方法有直接浸提法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、酶輔助提取法等[7]，超聲輔助提取法作為植物活性物質提取的新技術，具有節能、安全、高效等優點[8]。在女貞子黃酮提取物活性方面，研究降血脂功效較多[9-10]，在體外抗氧化方面鮮見報道。因此，本研究以女貞子總黃酮含量為評價指標，利用響應曲面法進行優化，并分析提取物對小鼠紅細胞、肝組織勻漿和肝線粒體丙二醛(malondialdehyde，MDA)生成量的影響，觀察其生物活性，以期為女貞子總黃酮的深度開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ICR雄性清潔級小鼠：體重(20±2) g，長春市億斯實驗動物技術有限責任公司，許可證號：SCXK(吉)-2016-0003；

顆粒飼料：長春市億斯實驗動物技術有限責任公司，許可證號：SCXK(吉)2015-0005；

女貞子：產地河北，吉林市售；

無水乙醇：分析純，天津市永大化學試劑有限公司；

蘆丁、硫酸亞鐵：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

亞硝酸鈉：分析純，天津市福晨化學試劑廠；

硝酸鋁：分析純，天津市大茂化學試劑廠；

氫氧化鈉：分析純，西隴化工股份有限公司；

過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)：分析純，北京遼寧泉瑞試劑有限公司；

VC：生工生物工程上海股份有限公司；

PBS固體粉末：北京索萊寶公司；

BCA檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒：南京建成生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

可見光分光光度計：722型，上海菁華科技有限公司；

電子天平：BS224S型，北京賽多利斯科學儀器有限公司；

高功率超聲波清洗器：KQ-800KDE型，昆山舒美超聲儀器有限公司；

中藥粉碎機：ZN-200型，中南制藥機械廠；

組織分散機：T10型，德國IKA公司；

離心機：5810R型，德國艾本德有限公司；

旋轉蒸發儀：EV311型，北京萊伯泰科公司；

鼓風干燥箱：202-1型，天津泰森儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 女貞子總黃酮的提取工藝流程 將女貞子粉碎后過60目篩，60 ℃干燥至恒重備用。稱取1.25 g女貞子粉末，加入一定量乙醇溶液，充分混勻后按一定的提取條件(提取時間、提取功率、乙醇體積分數、液料比)提取，3 000 r/min 離心10 min，取上清液過濾，置于旋轉蒸發儀中進行濃縮，將濃縮液定容至100 mL，即為女貞子總黃酮粗提液。

1.3.2 蘆丁標準曲線的繪制 精確稱取50.00 mg蘆丁溶于體積分數為40%的乙醇溶液中，充分溶解后轉移至25 mL 容量瓶中定容，制成蘆丁儲備溶液，精密吸取0.00，0.25，0.50，0.75，1.00，1.25 mL儲備溶液，分別置于10 mL具塞試管中，加蒸餾水補至1.25 mL，加質量分數5%的亞硝酸鈉水溶液0.25 mL，混勻后室溫放置6 min，加質量分數為5%的硝酸鋁水溶液0.25 mL，混勻后放置6 min，加1 mol/L 氫氧化鈉水溶液2.5 mL，加體積分數為40%的乙醇溶液定容至10 mL，混勻后放置反應15 min，于波長510 nm 處測定吸光度，以體積分數為40%乙醇溶液作為空白調零，以吸光度為縱坐標，蘆丁質量濃度為橫坐標繪制蘆丁標準曲線，線性回歸方程為A=2.625 4x+0.067 8(R2=0.999 4)，蘆丁在50～250 mg/L質量濃度范圍內具有良好的線性關系。

1.3.3 女貞子提取液中總黃酮含量的計算 精確稱取1.25 g 女貞子粉末，按“1.3.1”方法進行提取，精確吸取1 mL 粗提液采用“1.3.2”方法顯色測定溶液吸光度，根據式(1)計算總黃酮含量。

(1)

式中：

c——總黃酮含量，mg/g；

m1——粗提液樣品中黃酮的質量濃度，mg/L；

m2——粗提液定容后的體積，L；

m3——稀釋倍數；

m4——女貞子的質量，g。

1.3.4 單因素試驗設計

(1) 提取時間：精確稱取1.25 g女貞子樣品放入三角瓶中按液料比50∶1 (mL/g)與體積分數為60%的乙醇混合，在提取功率560 W下分別超聲提取20，40，60，80，100，120 min，分析提取時間對女貞子總黃酮提取效果的影響。

(2) 提取功率：精確稱取1.25 g女貞子樣品放入三角瓶中按液料比50∶1 (mL/g)與體積分數為60%的乙醇混合，分別在提取功率400，480，560，640，720，800 W下超聲提取60 min，分析提取功率對女貞子總黃酮提取效果的影響。

(3) 乙醇體積分數：精確稱取1.25 g女貞子樣品放入三角瓶中按液料比50∶1 (mL/g)與體積分數分別為30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%的乙醇混合，在提取功率560 W下超聲提取60 min，分析乙醇體積分數對女貞子總黃酮提取效果的影響。

(4) 液料比：精確稱取1.25 g女貞子樣品放入三角瓶中分別按液料比20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1，70∶1，80∶1 (mL/g)與體積分數為60%的乙醇混合，在提取功率560 W下超聲提取60 min，分析液料比對女貞子總黃酮提取效果的影響。

1.3.5 響應面試驗設計 在單因素試驗的基礎上，依據Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behenken試驗設計原理，以女貞子提取液中總黃酮含量為響應值，以提取時間、提取功率、乙醇體積分數和液料比為因變量進行四因素三水平的響應面分析試驗，優化超聲波輔助提取女貞子總黃酮工藝參數。

1.3.6 女貞子總黃酮的體外抗氧化試驗

(1) 女貞子總黃酮對小鼠紅細胞氧化溶血的影響：試驗小鼠飼養于溫度20～24 ℃，濕度50%～70%，12 h 明暗交替的環境。將小鼠摘除眼球取血，加入抗凝劑肝素鈉后5 000 r/min離心10 min，分離得到紅細胞，以冷生理鹽水洗滌3次，以生理鹽水配置成0.5%的小鼠紅細胞懸浮液備用。根據參照文獻[11]，修改如下：樣品組取試管分別加入0.3 mL不同質量濃度的總黃酮提取液，然后再加入1.0 mL 的小鼠紅細胞懸浮液，混勻后加入0.1 mL 100 mmol/L 的H2O2啟動反應，37 ℃溫育1 h后加入5.2 mL 生理鹽水，4 000 r/min離心10 min，取上清，415 nm 處測定吸光度(m1)。正常對照組以等體積的生理鹽水代替樣品和H2O2溶液，誘導對照組以等體積的生理鹽水代替樣品(m2)。溶血率和抑制率按式(2)和(3)進行計算。

(2)

(3)

式中：

c1——溶血率，%；

c2——抑制率，%；

m1——正常對照組吸光度，A；

m2——誘導對照組吸光度，A。

(2) 女貞子總黃酮對小鼠肝線粒體脂質過氧化的影響：根據參照文獻[12]，修改如下：取新鮮的小鼠肝組織，冷生理鹽水清洗血漬，濾紙吸干水分后，在組織勻漿機中用5 mmol/L 的PBS緩沖液制成10%的組織勻漿液，4 ℃、3 000 r/min 離心15 min，取上清，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，沉淀用PBS洗滌2次，加入PBS溶解沉淀，配置成肝線粒體懸浮液，以BCA試劑盒測定懸浮液蛋白質含量，配置成蛋白質濃度為10 mg/mL的肝線粒體懸浮液。樣品組取0.25 mL肝線粒體懸浮液于各試管中，加入0.1 mL不同質量濃度的總黃酮提取液，混勻后加入0.5 mmol/L FeSO4和0.5 mmol/L的VC溶液各0.1 mL；正常對照組以等體積的PBS代替FeSO4和維VC溶液，誘導對照組以等體積PBS代替樣品溶液，混勻后37 ℃溫育1 h，以MDA試劑盒說明書的方法測定532 nm處的吸光度并計算MDA含量。

(3) 女貞子總黃酮對小鼠肝組織勻漿體外生成MDA的影響：參照文獻[13]，修改如下：取10%肝組織勻漿液，5 000 r/min 離心15 min，取上清備用。用BCA蛋白試劑盒測定上清液中蛋白質的濃度。樣品組取1.0 mL 10%肝組織勻漿液與0.1 mL不同質量濃度的總黃酮提取液混合，加10 mmol/L的 FeSO430 μL、60 mmol/L的H2O220 μL，37 ℃溫育1 h后，冰育10 min終止反應。以MDA試劑盒說明書的方法測定532 nm處的吸光度并計算MDA含量。以等體積的生理鹽水代替樣品溶液作為對照組。

1.4 數據統計與分析

試驗重復3次，結果取平均值。數據用SPSS 16.0軟件進行統計分析，采用方差分析中的LSD法進行樣本均數的兩兩比較，P<0.05時有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取時間對女貞子總黃酮含量的影響 由圖1可知，當超聲時間從20 min增加到100 min時，總黃酮的含量隨著提取時間的延長逐漸增加，當提取時間達到100 min 時，總黃酮的含量達到最大值；隨著提取時間的繼續延長，總黃酮的含量反而呈下降趨勢，可能與提取時間太長，黃酮結構發生破壞或者發生降解有關[14]。因此選擇最佳提取時間為80 min。

圖1 提取時間對女貞子總黃酮含量的影響

Figure 1 Effect of the extraction time on total flavonoids yield fromLigustrumlucidumAit

2.1.2 提取功率對女貞子總黃酮含量的影響 由圖2可知，隨著提取功率的增大，女貞子中總黃酮的含量呈現先上升后下降的趨勢，在640 W時總黃酮的含量達到最大。可能是黃酮作為次生代謝產物，大部分存在于細胞膜中，樣品超聲后可使媒介粒子的速度和加速度增大，導致界面擴散層上的分子擴散速度加快，使黃酮加速溶出，當超聲波功率>640 W時，超聲波產生的空化效應會使黃酮分子與其他成分反應使黃酮的結構遭到破壞，導致提取量下降[15]。因此，選擇最佳提取功率為640 W。

2.1.3 乙醇體積分數對女貞子總黃酮含量的影響 由圖3 可知，當乙醇體積分數從30%增加到50%時，總黃酮含量呈現上升的趨勢，隨著乙醇體積分數的增加，材料細胞溶脹增強，提取劑能有效地向材料細胞內部滲透，從而使提取的總黃酮含量增加[16]。當乙醇體積分數超過60%后，隨著乙醇體積分數的增加，提取物中黃酮含量有所下降，可能是溶劑極性下降，水溶性黃酮溶出減少，同時雜質溶出增多，使黃酮溶解度下降[17]。因此選擇最佳乙醇體積分數為60%。

圖2 提取功率對女貞子總黃酮含量的影響

Figure 2 Effect of the extraction poweron total flavonoids yield fromLigustrumlucidumAit

圖3 乙醇體積分數對女貞子總黃酮含量的影響

Figure 3 Effect of the ethanol concentration on total flavonoids yield fromLigustrumlucidumAit

2.1.4 液料比對女貞子總黃酮含量的影響 由圖4可知，當液料比從20∶1 (mL/g)增加到60∶1 (mL/g)時，黃酮含量逐漸升高，這可能是液料比越大，溶劑中的黃酮質量越低，傳質推動力越大，提取速率增加，使提取率增大，在液料比為60∶1 (mL/g)時提取溶液中總黃酮含量最高。當液料比繼續增大時，黃酮的含量反而呈現下降的趨勢，可能是女貞子中雜質的溶出，影響了黃酮的溶出率[18]；也可能是進入溶劑的黃酮對未溶出黃酮有協同浸提作用[19]，造成提取溶液中總黃酮含量的減少。此外，過度增加溶劑使用量，會造成浪費，也會增加成本，造成后續蒸發濃縮的負擔，增加工作量，因此選擇最佳液料比為60∶1 (mL/g)。

圖4 液料比對女貞子總黃酮含量的影響

Figure 4 Effect of the ratio of solution and solid on total flavonoids yield fromLigustrumlucidumAit

2.2 女貞子總黃酮提取工藝優化

2.2.1 模型方程建立與顯著性檢驗 在單因素試驗基礎上，選用響應面法對女貞子總黃酮的提取工藝條件進行優化。利用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken設計，以提取時間、提取功率、乙醇體積分數、液料比為響應變量(見表1)，以黃酮含量為響應值進行數據擬合，結果如表2所示。

表1 響應面試驗設計因素水平表

表2 Box-Behnken試驗設計與結果

對表2數據進行多元回歸擬合，得到多元回歸方程：

Y=46.69-0.23A-2.35B+0.047C+2.07D-2.13AB-1.90AC+3.81AD+1.30BC+2.25BD+3.36CD-2.53A2-2.59B2-5.00C2-3.01D2

(4)

表3 回歸方程方差分析?

? *. P<0.05，差異顯著；**. P<0.01，差異極顯著。

2.2.2 響應面分析 響應面圖能夠直接反映各因素與響應值之間的關系以及兩因素間交互作用類型，并能形象描述回歸方程。由圖5(a)、(c)可知，當提取功率的水平為0時，女貞子總黃酮的含量隨著提取時間的延長呈先上升后下降的趨勢，當提取功率的水平變化到1時，隨著提取時間的延長，女貞子總黃酮的含量先趨于平穩后不斷下降，這與提取功率單因素試驗結果一致，即在較高提取功率的條件下，女貞子總黃酮的含量呈現下滑的趨勢；由圖5(b)、(d)可知，當一個因素一定時，女貞子總黃酮的含量隨另一個因素增加呈現先上升后下降的趨勢。

圖5 各因素交互作用對女貞子總黃酮含量影響

由Design-Expert 8.0.6軟件得出女貞子總黃酮的最佳提取條件為：提取時間110.49 min、提取功率605.52 W、乙醇體積分數60.27%、液料比65.30∶1 (mL/g)。考慮到實際操作的可行性，將最佳提取工藝調整為：提取時間110 min、提取功率640 W、乙醇體積分數60%、液料比65∶1 (mL/g)。在此條件下進行3次驗證實驗，所得女貞子提取液中總黃酮含量平均值為47.40 mg/g與預測值47.68 mg/g接近，說明該模型對女貞子總黃酮提取工藝條件參數優化可靠，具有較好的應用價值。

2.3 女貞子總黃酮的體外抗氧化研究

2.3.1 女貞子總黃酮對小鼠紅細胞氧化溶血的影響 由表4可知，H2O2可誘導細胞氧化損傷，加速細胞溶血，一定質量濃度范圍的總黃酮能抑制H2O2誘導的紅細胞出現自氧化溶血現象。隨著總黃酮質量濃度升高，紅細胞溶血率逐漸下降，總黃酮抑制紅細胞溶血的抑制率反而逐漸升高，提取物中總黃酮濃度與抑制率之間呈劑量依賴關系。當女貞子總黃酮濃度達到1 000 mg/L時，紅細胞溶血的抑制率可高達到39.05%，顯著高于其他各劑量組。

表4女貞子總黃酮對H2O2誘導小鼠紅細胞自氧化溶血的影響?

Table4EffectoftotalflavonoidextractsfromLigustrumlucidumAitonthehemolysisofmouseRBCs

總黃酮濃度/(mg·L-1)A415溶血率/%抑制率/%對照組0.16±0.02bcdef--誘導組1.94±0.04a100-2001.78±0.01b85.40±0.57a13.28±3.58abcd4001.77±0.13bc82.25±6.39ab16.48±6.49abcd6001.67±0.07bcd74.37±3.66bc24.48±3.72abc8001.53±0.07bcde66.37±3.56bc32.60±3.61ab1 0001.49±0.03bcde60.02±1.40bcd39.05±1.42a

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3.2 女貞子總黃酮對小鼠肝線粒體脂質過氧化的影響

由表5可知，總黃酮處理組小鼠肝線粒體MDA水平均低于正常誘導組，且隨著總黃酮濃度的增加，小鼠肝線粒體MDA水平逐漸降低，有效地抑制了脂質過氧化物MDA的生成，總黃酮濃度與MDA水平呈劑量—效應關系。隨著總黃酮濃度的增加，MDA的抑制率逐漸增加，當總黃酮濃度達到1 000 mg/L時，抑制率可達到53.24%，明顯高于200 mg/L劑量組。

表5女貞子總黃酮對小鼠肝線粒體MDA生成的影響?

Table5EffectoftotalflavonoidextractsfromLigustrumlucidumAitonMDAgenerationinmouselivermitochondria

總黃酮濃度/(mg·L-1)MDA含量/(nmol·mg-1)抑制率/%對照組1.48±0.05bcd-誘導組2.17±0.01a-2002.11±0.07ab22.20±2.56bcde4001.76±0.14bcd34.86±5.12bcd6001.47±0.14bcd45.72±5.12abc8001.36±0.03bcd49.82±1.00ab1 0001.27±0.15bc53.24±5.41a

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3.3 女貞子總黃酮對小鼠肝組織勻漿MDA生成的影響 如表6所示，在這2種體系中，女貞子總黃酮濃度在200～1 000 mg/L時，對小鼠肝組織勻漿MDA的生成具有抑制作用，且呈劑量—效應關系。當女貞子總黃酮濃度達到1 000 mg/L時，無誘導體系中MDA抑制率達到了25.56%，Fe2++H2O2誘導體系中MDA抑制率達到了36.10%。總體比較，女貞子總黃酮對誘導體系的小鼠肝組織勻漿MDA生成的抑制作用強于無誘導體系。

表6 女貞子總黃酮對大鼠肝組織勻漿MDA生成的影響?

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結論

本研究以女貞子總黃酮含量為指標，在單因素試驗的基礎上運用Box-Behenken試驗設計原理，進行響應面分析，得到超聲輔助提取總黃酮的最佳方案為：提取時間110 min、提取功率640 W、乙醇體積分數60%、液料比65∶1 (mL/g)，經試驗驗證提取的女貞子總黃酮含量平均值為47.40 mg/g，與理論值基本一致。大量研究[20]證實，植物黃酮有較好的抗氧化作用。因此通過體外抗氧化活性氧研究，適當劑量的女貞子黃酮能夠顯著抑制小鼠紅細胞溶血(P<0.05)，抑制率最高為39.05%；能夠顯著抑制小鼠肝線粒體MDA生成(P<0.05)，抑制率最高為53.24%；能夠顯著抑制肝組織勻漿中MDA生成(P<0.05)。上述表明，本研究優化的女貞子黃酮提取工藝，可獲得抗氧化能力較高的黃酮類物質，具有較好的開發利用價值。