HIF-1α基因多態性與VCI及MRI表現的相關研究

陳捷 王志敏 陶曉曉 黃丹江 解晶

血管性認知障礙（VCI）是一組包括由于血管因素導致的各種認知障礙類型，其中包括無癡呆型血管性認知障礙（VCI-ND）、血管性癡呆（VD）。研究認為，腔隙性腦梗死（LI）可能是血管性癡呆的主要腦血管疾病類型之一。低氧誘導因子（HIF）在哺乳動物體內是一種非常重要的氧調節因子，可以調節許多低氧相關基因的表達。與腦梗死后發揮缺氧缺血后的神經保護作用密切相關。本研究在基因水平上觀察血管性認知功能障礙患者MRI參數變化及影響，探討HIF-1α基因多態性與LI患者血管性認知功能障礙的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年1月至2017年5月本院收治的VCI患者68例。及同期正常體檢者50例。VCI-ND組43例，受教育程度：＜中學15例，≥中學28例。VD組25例：受教育程度：＜中學13例，≥中學12例。所有患者均符合美國國立神經病學與卒中研究所（NINDS）診斷標準及認知功能障礙標準［1-2］。排除標準：（1）合并其他各個系統嚴重疾病，嚴重心臟疾病，嚴重各系統性感染，嚴重肝、腎功能不全，自身免疫學疾病，腫瘤等。（2）拒絕簽署知情同意書者。本研究經醫院倫理委員會批準，患者及其家屬知情并簽署知情同意書。

1.2 方法 記錄所有患者一般資料（性別、年齡等）、家族情況。入院后統一由神經內科醫師采計算CMC評分；同時記錄其他心腦血管相關危險因素，如吸煙史和高血壓、糖尿病、高尿酸血癥、同型半胱氨酸血癥等病史。所有患者均行MRI檢查及HIF-1α基因多態性檢測。

1.3 MRI檢查 應用西門子Avanto的1.5T超導型磁共振成像掃描系統，梯度場強度40mT/m，梯度切換率150mT/m/ms，對所有受試者進行頭部MR/平掃，包括Tl加權像、T2加權像、彌散加權像和液體衰減翻轉恢復序列（Flair像）。所有MRI數據由對該研究不知情的兩位副主任醫師以上影像學醫師進行處理。如兩位影像學醫師對結果有異議，請第三位副主任醫師以上影像學醫師裁決。并進行皮質下白質疏松評分及腔隙性腦梗死評分。

1.4 基因檢測 于入院次日清晨空腹留取5ml靜脈血提取DNA。HIF-1α基因SNP的選擇基因多態性的檢測，選取代表性的SNPs位點共4個（rs3783752，rs4899056，rs1957757，rs10873142）。 使 用 primer 5.0設計引物（見表1），采用直接測序方法，讀取個體的基因型，所有基因檢測由華大基因公司完成。

表1 HIF基因SNPs位點分型所用引物及測序引物

1.5 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件。危險因素統計、認知功能量表測定及MRI參數比較均分層比較，基因比較首先分正常組及VCI組比較，后將VCI組分層比較。基因型行哈迪溫伯格平衡檢驗，計算基因型頻率；卡方檢驗兩組間等位基因型頻率分布差異。block根據 D'＞0.9以及 r2＞0.8進行定義。頻率 ＜3% 單倍型被排除不再進行統計學檢驗。計算各SNP間連鎖不平衡程度。估算各單倍型頻率，比較正常組和VCI組間等位基因頻率和單倍型頻率的差異。

2 結果

2.1 危險因素比較 見表2。

表2 各組受試者血管性危險因素的比較［n（%）］

2.2 認知功能評價及影像學比較 見表3。

表3 各組受試者認知功能評分及MRI 檢查結果的比較［分，（x±s）］

2.3 正常組與VCI組HIF-1α基因多態性 見表4。

2.4 VCI組分層HIF-1α基因多態性 見表5。

2.5 連鎖不平衡分析 正常組連鎖不平衡分析發現單倍型（rs3783752-rs4899056-rs1957757）高度連鎖（D'＞0.9，r2＞0.8），VCI組發現單倍型（rs3783752-rs1957757）高度連鎖，見圖1、2。

表4 兩組患者HIF-1α基因多位點基因型分布情況

表5 HIF-1α基因多位點基因型VCI組分層患者中的分布情況

圖1 正常組Linkage Disequilibrium分析

圖2 VCI組Linkage Disequilibrium分析

2.5 單倍體分析 見表6。

表6 HIF-1α基因多態性單倍體分析結果

2.6 VCI組HIF-1α基因多態性分層MRI評價 見表7。

表7 VCI組HIF-1α基因多態性分層MRI評價

3 討論

LI的發生機制通常由于顱內深部的小穿通動脈管壁發生梗阻性病變所致，約占所有缺血性腦血管病的25%［3］。LI由于臨床癥狀的低顯性易被忽視。結果顯示，LI不僅是缺血性腦血管病復發的風險因素，同時也可能是導致血管性認知功能障礙的重要危險因素之一。Edwards等一項大樣本臨床隨機對照研究（1636例）發現［4］，約47%的LI患者存在輕度認知功能損害。Makin［5］等Meta分析納入約7575名腦血管病患者，結果顯示2860名LI患者中約24%存在現認知功能損害現象。

本資料對所有患者進行危險因素篩查，發現各組受試者年齡。性別。糖尿病病史比較，差異無統計學意義，而吸煙史、高血壓病史以及短暫性腦缺血發作和卒中史比較，差異有統計學意義，與既往研究相類似。而認知功能評估及影像學比較，各組受試者MMSE 評分。CCSE 評分和CMC評分比較及MRI 檢查測得的皮質下白質疏松和腔隙性腦梗死的評分比較均有顯著意義。VD人群的白質疏松和腔隙性腦梗死評分均顯著高于VCI-ND人群及正常人群，研究結果與國內外研究結果類似。MRI可以顯示腦白質病變及特異性腦結構評估表現正常的腦白質區的功能。國外研究［6-7］顯示：腦白質的完整性與認知功能存在正相關性，腦白質的損傷與MCI的發生也存在強相關性。

本資料對HI F-1α基因多態性四個位點進行檢測，將人群分類按照是否存在認知功能障礙分成兩組，發現兩組rs4899056位點及rs10873142位點存在陽性意義，其中，rs4899056基因位點VCI組TT基因型分布頻率較正常組低，rs10873142基因位點VCI組CC基因型分布頻率較正常組低。而將認知功能障礙人群進行分層分析，結果未見異常。同時基因連鎖不平衡分析發現，正常人群中發現單倍型（rs3783752-rs4899056-rs1957757）高度連鎖，異常組僅為發現單倍型（rs3783752-rs1957757）高度連鎖，基因單倍體分析，單倍型塊（rs3783752- rs4899056-rs1957757-rs10873142）ATTC，GCCC，GCCT單倍體基因型兩組有顯著差異，其中ATTC，GCCC均為保護因素，GCCT為危險因素。但在各位點分層分析與MRI白質疏松和腔隙性腦梗死評分，均未見異常。

腦梗死與缺血缺氧機制密切相關，目前研究較多的HIF，是一種非常重要的氧調節因子，可以調節許多低氧相關基因的表達［6］。HIF由α和β兩個亞基構成，其中α亞基為調節亞基。HIF-1α亞基編碼基因位于人類染色體14q21-24，含15個外顯子和14個內含子。在HIF-1α基因內SNP位點有諸如一下幾個位點：rs3783752、C111A、rs61755705、rs4899056、rsl957757、rsl0873142、rs41508050、rsll549465、rsll549467、rsl802821。在21%O2和7%O2環境中檢測活體中HIF-1αmRNA表達水平，發現在缺氧條件下細胞內HIF-1α mRNA分布廣泛并高表達。在缺氧條件下，α亞基能與β亞基結合，形成一個二聚體。HIF的形成與低氧應答基因中的低氧應答元件有關。介導缺氧基因的轉錄表達，維持氧平衡的平衡。在缺血缺氧過程中，HIF-1α的羥化受到干擾，通過調整促凋亡蛋白Caspase 3靶基因表達。改善細胞能量代謝抑制凋亡。在氧糖剝奪（OGD）后，磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶信號通路可被激活。隨著缺血缺氧時間和程度的不同，細胞內HIF-1α也可通過誘導p53、Noxa、HGTDP，調節相關細胞毒作用調控細胞凋亡程度［7］。