夏枯草口服液對STAT3和NF-KB信號轉導通路的影響

李定祥 牛明輝 張杰?

夏枯草口服液由單味中藥夏枯草制備而成。《中國藥典》［1］指出夏枯草有清火、明目、散結、消腫的功效，具有降壓、降糖、抗菌、抗炎、抗過敏及抗病毒等藥理作用。臨床研究表明，夏枯草可顯著降低IL-1β、TNF-α等促炎性細胞因子水平［2-3］，對亞急性甲狀腺炎［4-5］、慢性乳腺炎［6］等炎性疾病也有顯著療效。JAK-STAT3信號通路是介導炎癥相關細胞因子信號傳導的重要通路，與體內炎癥反應具有非常密切的關系［7］。核因子KB（NF-KB）是一組調節廣泛基因表達的核蛋白因子，在參與炎癥反應，細胞增殖、分化與凋亡，免疫反應和腫瘤形成等相關的基因轉錄調控中有重要作用［8-9］。本文研究夏枯草口服液對STAT3及NFKB信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器 超凈臺（上海上凈凈化設備有限公司），電子天平（METTLER TOLEDO AL104型），Eppendorf 5810R離心機，徠卡Leica DMI3000 B倒置顯微鏡，Thermo CO2培養箱，TECAN F200酶標儀。

1.2 藥物與試劑 α-MEM培養基（Gibco公司），DMEM培養基（Gibco公司），胎牛血清（Gibco公司，批號10099-141），胰酶（Amresco公司），雙抗（Amresco公司），熒光素酶檢測試劑盒（Promega公司），IL-6（ProTech公司），TNF-α（Sigma公司）。4#細胞（穩定轉染了STAT1-luciferase和STAT3-luciferase報告基因質粒的HepG2細胞，培養條件為α-MEM+10%FBS），14#細胞（穩定轉染了NF-KB-luciferase報告基因質粒的293細胞，培養條件為DMEM+10%FBS）。夏枯草口服液（貴陽新天藥業股份有限公司，批號：170821）。

1.3 樣品制備 用直徑為22μM的微孔濾膜正壓過濾夏枯草口服液（總黃酮：11.7mg/ml；迷迭香酸：2.01mg/ml），經冷凍干燥成粉末，取夏枯草口服液凍干粉適量，以無菌超純水配制成200mg/ml的溶液，再以無菌超純水梯度稀釋得 100mg/ml、50mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、1mg/ml、0.2mg/ml、0.04mg/ml，置 -80℃冰箱過夜，備用。臨用前，以培養基稀釋10倍后用于篩選。

1.4 細胞培養及活性測定 人腫瘤細胞4#HepG2細胞和14#293細胞，細胞生長至對數生長期后，收集細胞，1000r/min離心5min，棄上清液，適量培養基懸浮，調整細胞濃度至3×105/ml。將細胞懸液接種到96孔細胞培養板中，每孔100μl，放置細胞培養箱（37℃，5%CO2）中培養48h后，吸去培養基，夏枯草組每孔加入100μl稀釋好的藥物，每藥設2復孔。夏枯草口服液終濃度分別為 20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.1mg/ml、0.02mg/ml和 0.004mg/ml。培養 1h 后每孔加入激動劑（IL-6/TNF-α，10ng/ml）11μl。設陰性對照組，不加激動劑和夏枯草溶液，設模型組，加入激動劑，但不加夏枯草溶液。培養5.5h棄去培養基，每孔加入1×細胞裂解液30μl，震蕩使細胞充分裂解。取20μl到酶標板中，加入30μl熒光素酶底物。酶標儀檢測，計算抑制率［抑制率%=（模型組熒光強度-夏枯草組熒光強度）/模型組熒光強度×100%］。

1.5 統計學方法 應用Prism Graphpad統計軟件計算IC50值。

2 結果

2.1 夏枯草口服液抑制STAT3信號通路 IL-6可激活STAT3信號通路，熒光強度OD值為620.0。夏枯草口服液0.5 mg/ml對STAT3信號通路抑制率為57.18%，1mg/ml時抑制率81.53%，20 mg/ml時抑制率為98.55%，表明夏枯草口服液對IL-6誘導的STAT3信號通路具有抑制作用，在一定濃度范圍內呈濃度依賴性（見表1）。其抑制STAT3的IC50為0.4591mg/ml（見圖1）。

表1 夏枯草口服液抑制STAT3信號轉導通路的活力

圖1 夏枯草口服液抑制STAT3信號轉導通路IC50

2.2 夏枯草口服液抑制NF-KB信號通路 TNF-α可激活NF-KB信號通路，熒光強度OD值為12958.5。夏枯草口服液0.5mg/ml對STAT3信號通路抑制率為58.36%，1mg/ml時抑制率91.29%，20mg/ml時抑制率為99.94%，表明夏枯草口服液對TNF-α誘導的NF-KB信號通路具有抑制作用，且呈濃度依賴性（見表2），其抑制NF-KB的IC50為0.3719mg/ml（見圖2）。

表2 夏枯草口服液抑制NF-KB信號轉導通路的活力

圖2 夏枯草口服液抑制NF-KB信號轉導通路IC50

3 討論

信號傳導與轉錄激活因子（STAT）蛋白家族是一個由STAT 基因編碼合成的蛋白質家族，可以被不同的細胞因子受體激活，在細胞因子-受體相互作用的過程中充當載體，保持信號在細胞內傳遞的內在特異性［10］。STAT的七個蛋白家族中，STAT3是一種廣泛表達于人和鼠各組織細胞的轉錄調節因子。JAK/STAT3信號通路是STAT3活化的一條經典途徑，較多細胞因子和生長因子通過JAK-STAT信號通路來傳導信號，包括白介素2～7、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子、生長激素、表皮生長因子、血小板衍生因子及干擾素等。研究發現，STAT3信號通路參與較多生理病理過程，STAT3的異常活化可導致先天免疫、適應性免疫，急、慢性炎癥，及腫瘤等疾病的發生［11］，是炎癥形成過程中不可或缺的關鍵性因素［12-13］。

核因子KB（NF-KB）是從鼠B淋巴細胞核提取物中發現的一種核蛋白因子。在靜息狀態下，IκB-α與NF-KB p65、p50兩個亞單位以失活狀態存在于細胞質中。腫瘤壞死因子TNF作用于腫瘤壞死因子受體TNFR，激活IKK（IκB kinase），活化的IKK會泛素化、磷酸化并降解IκB-α，使NF-KB兩個亞單位從失活狀態活化，并從細胞質轉移到細胞核內（尤其是p65亞單位），與相應的炎癥相關基因結合，啟動炎性細胞因子轉錄，誘發炎癥［14］。

本資料結果顯示，夏枯草口服液對IL-6誘導的STAT3信號通路和TNF-α誘導的NF-KB信號通路具有抑制作用，且呈濃度依賴性，揭示夏枯草口服液的體外抗炎作用機制，其對JAK-STAT、NF-KB信號通路的抑制作用需要進一步體內試驗的驗證，進一步明確其體內抗炎作用。同時還需要進一步探究其發揮抗炎作用機制的物質基礎。夏枯草含有的化學成分種類較多，酚酸是廣泛存在于夏枯草中的一類主要活性成分，文獻報道夏枯草中酚酸主要有迷迭香酸、迷迭香酸丁酯、咖啡酸、丹參素、迷迭香酸甲酯、3，4-二羥基苯甲酸等［15］。前期研究中發現，迷迭香酸能明顯抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹、醋酸所致小鼠毛細血管通透性增高及大鼠棉球肉芽腫性炎癥。另外，迷迭香酸能降低炎癥模型動物血清中炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β、CRP的含量［16］。需要進一步驗證迷迭香酸是否為夏枯草口服液抑制JAK-STAT、NF-KB信號通路的物質基礎，為夏枯草口服液抗炎作用機制提供依據，為夏枯草的臨床應用和進一步開發起指導作用。