參芪補(bǔ)肺湯對(duì)慢阻肺大鼠氣道平滑肌細(xì)胞中相關(guān)因子的影響

吳桂英 張 葵 張湘燕 閆 萍 楊 柱

(貴州省人民醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550002)

?

參芪補(bǔ)肺湯對(duì)慢阻肺大鼠氣道平滑肌細(xì)胞中相關(guān)因子的影響

吳桂英 張 葵 張湘燕 閆 萍 楊 柱1

(貴州省人民醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550002)

目的 探討參芪補(bǔ)肺湯對(duì)慢阻肺(COPD)大鼠氣道平滑肌細(xì)胞(ASMCs)增殖中組蛋白去乙酰基酶2(HADC2)、乙酰化組蛋白H4表達(dá)的影響。方法 將SD大鼠隨機(jī)分為正常組和COPD模型組。原代培養(yǎng)大鼠ASMCs取4～6代細(xì)胞，分為空白組、模型組、中藥低劑量組、中藥高劑量組和氨茶堿組。其中空白組為正常培養(yǎng)ASMCs，不予處理。模型組、中藥低、高劑量組和氨茶堿組為COPD模型組培養(yǎng)ASMCs，模型組加入香煙提取物(CSE)及正常組大鼠血清；中藥低劑量組加入CSE及中藥低劑量組大鼠血清；中藥高劑量組加入CSE及中藥高劑量組大鼠血清；氨茶堿組加入CSE及氨茶堿。細(xì)胞免疫組織化學(xué)檢測(cè)大鼠ASMCs增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)及各組ASMCs中HDAC2、H4蛋白的表達(dá)。結(jié)果 與空白組比較，模型組大鼠ASMCs明顯增殖，ASMCs中的HDAC2表達(dá)明顯降低，乙酰化組蛋白H4表達(dá)明顯增高(P<0.05)。與模型組比較，中藥低劑量組ASMCs增殖和HDAC2、乙酰化組蛋白H4表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；中藥高劑量組ASMCs平滑肌細(xì)胞增殖明顯下降，ASMCs中的HDAC2表達(dá)明顯增高，乙酰化組蛋白H4的表達(dá)明顯降低(P<0.05)；氨茶堿組ASMCs增殖降低、ASMCs中的HDAC2表達(dá)明顯增高(P<0.05)，乙酰化組蛋白H4表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論 參芪補(bǔ)肺湯可抑制ASMCs增殖，其機(jī)制可能通過(guò)提高ASMCs中HDAC2的表達(dá)、抑制組蛋白H4的表達(dá)，影響其平衡狀態(tài)發(fā)揮作用。

參芪補(bǔ)肺湯；慢性阻塞性肺疾病；氣道平滑肌細(xì)胞；組蛋白去乙酰基酶2；乙酰化組蛋白H4

以益氣補(bǔ)肺活血化痰法組方的參芪補(bǔ)肺湯能明顯改善慢性阻塞性肺疾病(COPD)穩(wěn)定期肺氣虛證患者癥狀，穩(wěn)定肺功能，阻止肺功能下降〔1〕,抑制氣道平滑肌增殖，但其機(jī)制不清楚。研究證實(shí)組蛋白去乙酰基酶(HDAC)2和乙酰化組蛋白H4參與COPD 支氣管平滑肌增殖〔2〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)氣道平滑肌細(xì)胞(ASMCs)，觀察參芪補(bǔ)肺湯對(duì)COPD大鼠ASMCs增殖及對(duì)ASMCs中HDAC2、H4表達(dá)的影響，從細(xì)胞水平探討參芪補(bǔ)肺湯抑制氣道平滑肌增殖機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 清潔級(jí)SD大鼠由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心購(gòu)置；脂多糖、噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒為美國(guó)Sigma公司；HDAC2抗體、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κBp65抗體為美國(guó)RD公司；兔抗肌動(dòng)蛋白(α-actin)抗體為英國(guó)Abcam公司。注射用氨茶堿，常州蘭陵制藥有限公司，批號(hào)：0911022，參芪補(bǔ)肺湯(黃芪30 g、黨參15 g、補(bǔ)骨脂15 g、丹參30 g、百部15 g、桑白皮10 g)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院購(gòu)置,水煎2次,濃縮為含生藥2 g/ml的藥液。雄獅牌香煙(焦油量：13 mg，煙氣煙堿量：1.2 mg，煙氣一氧化碳量：13 mg)，杭州利群卷煙廠。

1.2 含藥血清制備 選取(200±20)g的SD大鼠15只，隨機(jī)分為中藥高劑量組、中藥低劑量組和正常組，每組5只。中藥高、低劑量組分別給予參芪補(bǔ)肺湯水煎劑灌胃，劑量分別為每天5.04 g/100(相當(dāng)于成人常規(guī)臨床用量的4倍)、1.26 g/100 g(相當(dāng)于成人常規(guī)臨床用量等效用量)，正常組予生理鹽水灌胃1 ml/100 g。每日2次，連續(xù)5 d，末次給藥后2 h，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，并用0.45 μm濾膜過(guò)濾，56℃水浴滅活30 min，-20℃保存?zhèn)溆谩：幯宓氖褂媒K濃度為5%。

1.3 香煙提取物(CSE)制備 使用前30 min準(zhǔn)備，將香煙點(diǎn)燃后，其過(guò)濾嘴一端連接橡皮管，橡皮管的另一端連接洗耳球。洗耳球根據(jù)操作方式，提前測(cè)量平均容量。準(zhǔn)備一只空的密閉瓶，含有10 ml DMEM培養(yǎng)基，吸取約300 ml的煙霧注入瓶中，搖勻，使煙霧融入DMEM中，即為原液〔3〕。

1.4 肺氣虛證COPD大鼠模型的建立 參照文獻(xiàn)〔4〕復(fù)制COPD肺氣虛證大鼠模型，方法：將脂多糖配制成1 mg/ml的溶液，4℃保存。造模開(kāi)始第1、14天注射配制好的脂多糖溶液0.2 ml注入氣道內(nèi)，第2天至13天、第15天至第28天，每日將大鼠放在大約60 cm*40 cm*50 cm的儲(chǔ)物箱中內(nèi)被動(dòng)吸煙，每次每籠大鼠1 h，5只大鼠/籠，2次/d，每次間隔4 h。大鼠被動(dòng)吸煙的方法為將點(diǎn)燃的雄獅牌香煙放在鼠籠架上，讓大鼠被動(dòng)吸煙。肺氣虛證COPD模型大鼠造模共28 d。

1.5 大鼠ASMCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 肺氣虛證COPD大鼠模型造模成功后，隨機(jī)挑選模型大鼠以及正常生長(zhǎng)未做處理的大鼠，麻醉后將大鼠放血處死，鈍性分離出氣管，用手術(shù)剪分離出大鼠完整的心肺組織。將心肺組織置入4℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)液中，迅速放到無(wú)菌操作臺(tái)上，再用含有100 U/ml的青、鏈霉素的PBS液漂洗3次，分離出氣管分叉以下的支氣管，眼科剪剪去外膜，用刀片刮去內(nèi)膜，獲得較干凈的支氣管平滑肌塊。將分離的組織塊剪成組織小塊，并貼在培養(yǎng)孔板面上，37℃培養(yǎng)箱放置2 h后添加500 μl DMEM高糖+20%胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基，4 h后再添加培養(yǎng)基至2 ml/孔。待組織塊周?chē)绯黾?xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后進(jìn)行傳代，并做細(xì)胞純化處理，選用4～6代的細(xì)胞。培養(yǎng)的原代氣道平滑肌細(xì)胞經(jīng)免疫組織化學(xué)法鑒定平滑肌細(xì)胞特有的α-肌動(dòng)蛋白〔5〕。

1.6 分組及干預(yù) 原代培養(yǎng)的ASMCs分為空白組、模型組、中藥低劑量組、中藥高劑量組和氨茶堿組。其中空白組為正常大鼠氣道平滑肌培養(yǎng)出的ASMCs，不予處理。另外四組為肺氣虛證COPD模型大鼠的氣道平滑肌培養(yǎng)出的ASMCs。模型組：加入CSE及正常組血清。中藥低劑量組：加入CSE及中藥低劑量組血清。中藥高劑量組：加入CSE及中藥高劑量組血清。氨茶堿組：加入CSE及10 μmol/L氨茶堿，各組干預(yù)處理后24 h進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.7 平滑肌細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)測(cè)定ASMCs增殖 24 h干預(yù)處理后的各組細(xì)胞經(jīng)無(wú)水乙醇固定細(xì)胞，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法(SP)檢測(cè)PCNA蛋白表達(dá)。空白組ASMCs用PBS代替一抗。PCNA陽(yáng)性表達(dá)主要為ASMCs核呈棕黃色或者棕褐色。用IPP6.0分析軟件測(cè)出平均光密度值。

1.8 免疫組化檢測(cè)ASMCs中HDAC2和H4蛋白表達(dá) 爬片后細(xì)胞進(jìn)行分組干預(yù)后，用無(wú)水乙醇固定細(xì)胞，采用SP檢測(cè)HDAC2、H4蛋白表達(dá)。HDAC2、H4陽(yáng)性表達(dá)主要為ASMCs細(xì)胞核為黃色、棕黃色或者棕褐色。用IPP6.0測(cè)出平均光密度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件，多組間差異顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析,多組間兩兩比較采用LSD法。

2 結(jié) 果

2.1 ASMCs細(xì)胞鑒定 顯微鏡下,經(jīng)原代培養(yǎng)的ASMCs呈梭形,有較長(zhǎng)的突起,圓形的細(xì)胞核位于細(xì)胞中央,呈疏密相間、典型“峰和谷”生長(zhǎng)狀態(tài)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見(jiàn)ASMCs α-actin陽(yáng)性表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞為ASMCs。

2.2 PCNA測(cè)定結(jié)果 與空白組(0.131 0±0.003 92)比較，模型組PCNA蛋白表達(dá)(0.194 0±0.012 36)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，中藥低劑量組PCNA蛋白表達(dá)(0.189 5±0.005 20)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，中藥高劑量組(0.159 5±0.005 45)和氨茶堿組(0.162 3±0.005 38)PCNA蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.3 免疫組化檢測(cè)ASMCs中HDAC2、H4蛋白表達(dá) 與空白組比較，模型組HDAC2表達(dá)的顏色均明顯變淺，H4蛋白表達(dá)的顏色明顯加深。與模型組比較，中藥低劑量組中HDAC2、H4蛋白表達(dá)顏色相近，中藥高劑量組HDAC2蛋白表達(dá)顏色深于模型組，H4蛋白表達(dá)則淺于模型組。氨茶堿組HDAC2蛋白表達(dá)顏色深于模型組，H4蛋白表達(dá)與模型組無(wú)區(qū)別。見(jiàn)圖2,表1。

圖1 各組PCNA測(cè)定結(jié)果(倒置顯微鏡，×100)

圖2 ASMCs中HDAC2、H4蛋白表達(dá)(DAB,×100)

表1 各組大鼠ASMCs中乙酰化組蛋白H4、HDAC2的蛋白表達(dá)

與空白組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

3 討 論

COPD的重要病理特征之一就是氣道重構(gòu)，慢性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致氣道壁損傷和修復(fù)反復(fù)發(fā)生，造成氣道狹窄，導(dǎo)致氣道壁結(jié)構(gòu)重構(gòu)，引起氣道阻塞〔6〕。氣道平滑肌細(xì)胞的增殖不僅使氣道對(duì)刺激的收縮更強(qiáng)烈，加重氣道高反應(yīng)性，更重要的是能使氣道壁增厚，從而使氣道狹窄，發(fā)生不可逆的氣流阻塞。

組蛋白乙酰化能促進(jìn)細(xì)胞增殖〔7〕,組蛋白乙酰化程度主要受真核細(xì)胞內(nèi)組蛋白乙酰化酶(HAT)和HDAC共同調(diào)控〔8〕。HDACs 可以抑制組蛋白的乙酰化，在核心組蛋白的過(guò)度乙酰化方面起著重要作用〔9〕。HATs 和HDACs 之間的平衡失調(diào)導(dǎo)致組蛋白非正常的乙酰化，使基因表達(dá)失控，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖，腫瘤的發(fā)生〔10〕。HAT/HDAC作用于組蛋白，可影響COPD氣流阻塞程度及疾病預(yù)后〔11〕。

本實(shí)驗(yàn)提示HDAC2和乙酰化的組蛋白H4在ASMCs增殖中發(fā)揮重要作用。參芪補(bǔ)肺湯高劑量組能抑制COPD大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的增殖，同時(shí)，ASMCs中HDAC2蛋白質(zhì)表達(dá)明顯增高，乙酰化的組蛋白H4表達(dá)明顯降低。氨茶堿組能抑制COPD大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的增殖，同時(shí)，ASMCs中HDAC2蛋白質(zhì)表達(dá)明顯增高，而乙酰化的組蛋白H4表達(dá)無(wú)明顯降低。進(jìn)一步說(shuō)明中藥抑制COPD大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的增殖效應(yīng)，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)組蛋白乙酰化和去乙酰化平衡，使組蛋白去乙酰化，HDAC2與乙酰化的組蛋白H4達(dá)到平衡狀態(tài)，從而影響COPD大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的增殖。

綜上所述，氨茶堿組能抑制COPD大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的增殖，但不完全是影響蛋白乙酰化和去乙酰化平衡達(dá)到的。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)明確了中藥抑制ASMCs增殖的部分機(jī)制，為臨床用藥提供了理論依據(jù)。

1 張 葵,張培琴,陳昱江,等.參芪補(bǔ)肺湯對(duì)慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期肺氣虛證患者肺功能的影響〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012;18(1):213-6.

2 吳桂英,張 葵,閆 萍,等.參芪補(bǔ)肺湯對(duì)慢性阻塞性肺疾病肺氣虛證大鼠氣道平滑肌中乙酰化組蛋白H4、HDAC2和NF-κB p65表達(dá)的影響〔J〕.中藥新藥與臨床藥理,2014;25(6):688-93.

3 陳宏斌,徐永健，謝俊剛,等.香煙提取物對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞增殖中ERKs及NF-KB表達(dá)的影響〔J〕.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版,2007;36(4):544-7.

4 李澤庚,彭 波,張杰根,等.肺氣虛證模型大鼠的建立〔J〕.北京中醫(yī),2005;24(1):53-5.

5 楊 誠(chéng),梁瑞韻,黃林潔,等.三種方法培養(yǎng)慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的比較〔J〕.中國(guó)組織工程研究,2012；16(50):9448-52.

6 中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)慢性阻塞性肺疾病病學(xué)組.慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)〔J〕.中華結(jié)核與呼吸雜志,2013；36(4):255-64.

7 Adcock IM,Ford P,Ito K,etal.Epigenetics and airways disease〔J〕.Respir Res,2007;7:21.

8 李 霞，張玉軍.組蛋白H4 的共價(jià)修飾在表觀遺傳調(diào)控中的作用研究進(jìn)展〔J〕.山東醫(yī)藥,2013;53(15):91-3.

9 李梅華,鐘小寧,文明智,等.紅霉素對(duì)香煙煙霧刺激的人巨噬細(xì)胞組蛋白去乙酰化酶3 表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國(guó)免疫學(xué)雜志,2014;30(5):600-3.

10 Groselj B，Sharma NL，Hamdy FC，etal.Histone deacetylase inhibitors as radiosensitisers:effects on DNA damage signalling and repair 〔J〕.Br J Cancer，2013;108( 4):748-54.

11 竇麗陽(yáng),徐治波,馮玉麟,等.組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶/組蛋白去乙酰基酶在慢性阻塞性肺疾病發(fā)病機(jī)制和治療中的研究進(jìn)展〔J〕.國(guó)際呼吸雜志,2007;27(19):1463-6.

〔2015-12-30修回〕

(編輯 袁左鳴)

Effects of Shenqi Bufei Decoction on the expression of HDAC2 and histone acetylation H4 in airway smooth muscle cells proliferation of COPD rat model

WU Gui-Ying,ZHANG Kui,ZHANG Xiang-Yan,et al.

Guizhou Provincial People's Hospital，Guiyang 550002，Guizhou,China

Objective To observe the effects of Shenqi Bufei Decoction on the expression of HDAC2 and histone acetylation H4 in airway smooth muscle cells (ASMCs) proliferation of COPD rat model. Methods The 4～6 cells of cultured primary rat ASMCs were divided into blank,model,low,high dose Chinese medicine and aminophylline groups. ASMCs of the blank control group were normally cultured airway smooth muscle cells without treatment. ASMCs of the model group,low dose Chinese medicine group,high dose Chinese medicine group and aminophylline group respectively were the airway smooth muscle cells of the COPD rat. The model group was stimulated with cigarette smoke extract (CSE) and serum of the low,high dose Chinese medicine and aminophylline were added with low,high dose Chinese medicine and aminophylline respectively. The expression of proliferation cell nuclear antigen (PCNA) and histone deacetylase 2(HDAC2),acetyl histone H4 cell proliferation were tested by immunohistochemical staining.Results Compared with blank group,the airway smooth muscle cells proliferation and expression of cetyl histone H4 protein were significantly increased (P<0.05),the expression of HDAC2 protein was significantly decreased of model group(P<0.05). Compared with the model group,there was not significant difference between low-dose Chinese medicine group and model group(P>0.05),the airway smooth muscle cells proliferation and expression of acetyl histone H4 protein were significantly decreased (P<0.05),the expression of HDAC2 protein was significantly increased of the high dose Chinese medicine group (P<0.05),the airway smooth muscle cells proliferation was significantly decreased(P<0.05),the expression of HDAC2 protein was significantly increased(P<0.05) and expression of acetyl histone H4 protein was unchanged of the aminophylline group (P>0.05).Conclusions Shenqi Bufei decoction can restrain the proliferation of ASMCs of COPD by increasing the expression of HDAC2,inhibiting the expression of acetyl histone H4 in airway smooth muscle cell.

Shenqi Bufei Decoction;COPD; Airway smooth muscle cell; Histone deacetylase 2;Acetyl histone H4

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81160450)；貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目〔黔科合SY字(2012)3142〕

1 貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院

張 葵(1968-)，女，博士，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治老年病研究。

吳桂英(1958-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治老年病研究。

R285.5

A

1005-9202(2016)19-4696-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.010