反相高效液相色譜法測定土荊皮藥材中土荊皮乙酸含量的再探究

隋友樂 朱愛軍(通訊作者)

264002中國人民解放軍第一0七醫院健康管理中心，山東 煙臺

土荊皮(Cortex Pseudolaricis)藥材系松科植物金錢松的根皮和近根樹皮的干燥品，性辛溫，其醇提物臨床上用于治療手足真菌感染、濕疹、神經性皮炎等[1]。研究表明，土荊皮藥材中的二萜酸類是其發揮抗真菌、抗腫瘤、抗生育作用的主要有效成分[2，3]，其中以土荊皮乙酸的(PAB)含量最高、活性最強[4]。本文探究了土荊皮藥材中土荊皮乙酸的反向高效液相色譜含量測定方法，與已報道的方法相比，該方法的優勢有兩方面[5-6]：①采用了超聲波提取法處理供試品，與經典的回流提取法相比更方便快捷且提取溫度更低，干擾物質提出少且測得含量明顯高于報道值；②采用了乙腈-水作為流動相，在實驗過程中我們發現采用該流動相分離效果明顯優于甲醇-水洗脫系統。

儀器與試藥

高效液相色譜儀：LC-10AT；超聲波清洗器：KQ-500E 型醫用；電子天平：AB135-S；土荊皮乙酸標準品：購自中國食品藥品檢定研究院；土荊皮藥材；乙醇、乙腈、甲醇、丙酮均為色譜純，水為超純水。

含量測定

色譜條件：色譜柱：InersilRODS-3(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水-三氟乙酸(500:500:1)；流速1.0 mL/min；柱溫室溫；檢測波長260 nm；進樣量20 μL。在此色譜條件下[7]，土荊皮乙酸與提取物中其他組分有較好的分離度。對照品與供試品的保留時間一致(9.87 min)，對照品以及供試品的色譜圖，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖(t/min)

溶液制備：①供試品溶液制備：精密稱取土荊皮藥材粉末0.456 74 g，置于25 mL 燒杯中，加水5 mL，浸泡2 h，加入90%乙醇10 mL，超聲波提取20 min，過濾，甲醇洗滌(5 mL×3)，合并濾液、洗滌液，轉移至100 mL容量瓶中丙酮定容，即得。②對照品溶液的制備：精密稱取干燥過的土荊皮乙酸對照品5.31 mg，置100 mL 容量瓶中，甲醇定容，搖勻，精密吸取1 mL 置10 mL 量瓶中甲醇定容，得濃度5.31 μg/mL的對照品溶液。

線性關系考察：分別精密吸取供試品溶液制備項下儲備溶液0.5 mL、1 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL 置 于10 mL量瓶中用甲醇定容，分別得到2.66 μg/mL、 5.31 μ g/mL 、 21.24 μ g/mL 、42.48 μ g/mL、53.10 μg/mL 對 照 品 溶液。按色譜條件項下色譜條件測定，以濃度為縱坐標，以峰面積為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程：Y=0.29×10-3X-0.16×10-3，r=0.999 6。證明土荊皮乙酸在進樣濃度2.66～53.1 μg/mL范圍內線性關系良好。

穩定性試驗：取“對照品溶液的制備項”下供試品溶液，按“色譜條件”項下色譜條件在0、2、4、6、8 h各進樣1 次，記錄峰面積，RSD 2.12%(n=5)，表明供試品溶液在8 h內穩定性良好。

重復性試驗：精密稱取同一批樣品6份，每份約0.45 g，按“對照品溶液的制備”項下供試品溶液制備方法處理，精密吸取20 μL，按照“色譜條件”色譜條件測定，記錄峰面積，按照“線性關系考察”項下的標準曲線計算測得量。土荊皮乙酸的測得量分別為7.88、7.78 μg、7.26 μg、8.08 μg、7.82 μg、7.97 μg，RSD 3.34%(n=6)，表明方法重復性良好。

精密度試驗：精密吸取土荊皮乙酸對照品溶液(5.31 μg/mL)按“色譜條件”項下色譜條件重復進樣6 次[8]，20 μL/次，紀錄峰面積。結果：RSD=1.35%(n=6)，表明儀器精密度良好。

加樣回收率試驗：精密稱取已知含量的土荊皮乙酸的土荊皮9份，加入土荊皮乙酸對照品溶液10 mL，按照“對照品溶液的制備”項下方法處理，測定含量，并計算回收率，結果平均回收率98.69%，RSD=1.58%(n=9)，表明本方法回收率良好。

表1 樣品中土荊皮乙酸的含量

樣品含量測定：樣品提取率測定按照“溶液制備”項下制備供試品溶液，按照“色譜條件”中的測定，記錄峰面積，利用線性方程計算土荊皮乙酸的含量(mg/g)，見表1。

討 論

供試品制備方法的選擇：和藥典及報道的供試品制備方法相比，本實驗選用了提取效率更高的超聲波提取法，在提高檢測效率同時，可有效避免高溫對土荊皮乙酸的破壞[9]。

色譜條件的選擇：為能在適宜的分析時間內獲得目標成分的完全分離，在實驗過程中首先嘗試了甲醇-水洗脫系統，發現用該流動相洗脫時基線不平穩，分離度較差，故嘗試了以乙腈-水-三氟乙酸作為流動相，發現在該條件下，基線平穩，待測組分分離良好，故最終確定用乙腈-水-三氟乙酸作為流動相。經考察，柱溫考察了20～40℃范圍內對分離度的影響不大，故選用室溫。

本文對采用超聲輔助浸提的方法制備土荊皮供試品，再探究了RP-HPLC法測定土荊皮中土荊皮乙酸的含量。測得土荊皮中土荊皮乙酸含量4.27 mg/g，RSD 3.34%，精密度實驗RSD 值2.12%(n=6)，重現性實驗的RSD 值3.34%(n=6)，加樣回收率98.69%，RSD 1.58%(n=9)。實驗結果表明，該方法的精密度、穩定性、加樣回收率均滿足測定要求。本研究為土荊皮的質量標準制定提供了依據，也為其深入開發利用提供研究基礎。