活血膠囊激活PI3K/Akt/Nrf2/HO-1通路對血管內皮細胞發揮抗氧化損傷作用*

趙 靜，袁瑞華，王海芳，鄧國榮，張琳萍，曹情雯，霍雪萍，趙向絨，劉勤社△

（1.陜西中醫藥大學中西醫結合心血管病專業，陜西省中西醫結合心血管病防治重點實驗室，陜西 西安 712046；2.陜西中醫藥大學第二附屬醫院心內科，陜西 西安 712000；3.西安交通大學醫學部中西醫結合心血管專業，陜西 西安 710061；4.陜西省中醫醫院醫療管理處，陜西 西安 710003；5.陜西省人民醫院中心實驗室，陜西 西安 710068）

血管內皮層不僅是血液和組織的屏障，還能夠合成多種血管活性物質，從而調節血管張力和血管通透性。血管內皮細胞（vascular endothelial cell，VEC）在創傷修復、血管生成、止血等一系列生理和病理過程中發揮著重要作用。VEC損傷是多種疾病發生、發展的基礎，保持VEC結構和功能的完整性對于維持心血管系統穩態調節極為重要。VEC損傷和功能失常與多種心血管疾病（如冠心病、高血壓、糖尿病等）均有密切的關系。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是老年性慢性心血管疾病的共同病理基礎，而引起AS的主要原因之一是VEC氧化損傷。從整體、細胞、分子水平研究對VEC具有抗氧化損傷作用的藥物對于心血管疾病的防治研究具有重要意義[1]。

活血膠囊（以下簡稱HXJN）由黃芪、紅花、赤芍、川芎、桃仁、牛膝、當歸、生地、枳殼、桔梗、酸棗仁、甘草12味中藥組成，具有補氣養血、活血化瘀、理氣安神等功效，臨床用于治療冠心病氣虛血瘀證具有良好療效，但其藥理學作用機理和分子機制尚未完全闡明。既往動物實驗表明，HXJN可縮小動脈粥樣硬化斑塊面積，減少斑塊內巨噬細胞浸潤，降低斑塊內炎性因子表達，具有抗炎和增強斑塊穩定性的作用[2-3]。筆者前期對于黃芪、紅花和赤芍等藥材中主要活性成分的藥理學研究顯示，黃芪甲苷（astragaloside IV，AS-IV）[4]、黃芪皂苷 III[5]、羥基紅花黃色素 A（hydroxy-Safflower Yellow A，HSYA）[6]和芍藥苷（ paeoniflorin，PF）[7]等活性單體成分可抑制血管內皮細胞的炎性反應，同時還具有不同程度的抗氧化作用[8-10]。然而單個藥物成分的研究既不能如實反映復方中的活性成分含量與比例關系，也難以體現不同成分的綜合作用，不能夠全面闡釋復方的藥理學作用和作用機制。因此，本研究通過制備HXJN含藥血清和提取物水溶液，離體培養小鼠腦微血管內皮細胞（brain microvascular endothelial cells，bEND.3），采用 H2O2誘導細胞氧化損傷模型，研究HXJN的抗氧化損傷作用及其相關分子機制，為其藥理學作用提供直接的實驗室證據。

1 材料和方法

1.1 材料 小鼠bEND.3細胞購自上海拜力生物技術公司。RPMI-1640細胞培養基和胎牛血清購自Clontech公司。PI3K抑制劑LY294002、Akt抑制劑perifosine、Nrf2抑制劑 ML385，以及WST-1細胞增殖和細胞毒性檢測試劑盒、細胞漿蛋白和核蛋白抽提試劑盒均購自碧云天生物技術公司。RNA提取試劑盒、反轉錄及qRT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司。抗β-actin抗體、抗ph-Akt/Akt一抗和抗ph-Nrf2/Nrf2一抗購自美國Cell signaling公司，抗HO-1一抗購自美國Abcam公司。所用二抗購自北京康為世紀生物科技公司。主要儀器有CO2細胞培養箱（美國Napco公司），倒置光學顯微鏡（日本Olympus公司），臺式冷凍離心機Allegra 64R（德國Beckman公司），Model 680型酶標儀（美國Bio-Rad公司），Eco Real-Time PCR擴增儀（美國Illumina公司）和化學發光儀（美國Alpha Innotech公司）。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清制備 健康雄性SD大鼠，體質量200～220 g，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（陜）2012-003。按照人用劑量換算大鼠給藥劑量，將HXJN（西安大唐制藥集團有限公司生產，批號：B20020336）配制成 0.09 g/mL生理鹽水溶液，每只大鼠每次灌胃2 mL，對照組灌服等量生理鹽水，1日2次，連續5 d，末次給藥前禁食12 h，給藥后1 h麻醉動物后經腹主動脈取血，離心分離血清，56℃滅活30 min，過濾除菌，分裝，-80℃保存備用。

1.2.2 HXJN提取物溶液制備 將3粒活血膠囊（0.9 g）溶于6 mL無血清RPMI-1640細胞培養基，充分溶解，3 000 rmp離心5 min，過濾除菌，分裝，-80℃保存備用。

1.2.3 細胞培養 在 37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱中，bEND.3細胞貼壁生長于含有10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養液中，0.025%胰酶消化傳代。取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.4 細胞活力檢測 將細胞以1×104個/孔的密度接種于96孔細胞培養板中，加入200 μL完全培養液培養，每組設5個復孔。次晨換為100 μL含不同濃度含藥血清或HXJN提取物的新鮮培養液處理。24 h后每孔加入10 μL WST-1溶液，在細胞培養箱內繼續孵育1~1.5 h，充分混勻，450 nm處測定吸光度。采用公式“細胞活力值（實驗組）=[OD（實驗組）/OD（對照組）]×100%”計算各組細胞活力值。

1.2.5 實時定量 RT-PCR檢測HO-1基因表達bEND.3細胞在6孔培養板中生長至90%鋪滿，以高濃度（750 μg/mL）HXJN 提取物處理細胞 4、8、16 h，利用TRIzol試劑裂解細胞收集裂解液，提取總RNA。按照反轉錄試劑盒說明書以1 μg總RNA為模板反轉錄出cDNA鏈。按照試劑盒說明書以cDNA為模板進行PCR反應。引物：β-actin：正向引物 5′-TAGGCGGACTGTTACTGAGC-3';反向引物 TGCTCCAACCAACTGCTGTC；HO-1：正向引物 5′-GCTCACGGTCTCCAGTC-GCC-3′；5′-GGCGACTGGAGACCGTGAGC-3′。反應條件：95 ℃變性 1 min，58 ℃退火45 s，72℃延伸45 s，設35個循環。以β-actin作為內參基因，計算同一樣本中目的基因的含量比值，評價目的基因表達水平。

1.2.6 Western Blot檢測目標蛋白表達 生長于6孔細胞培養板中的細胞經過適當藥物處理后，每孔加入100 μL 2×SDS樣品緩沖液，直接收集細胞裂解物；或采用試劑盒分離胞漿蛋白和核蛋白。采用氨基黑法進行蛋白定量。95℃變性10 min后按照目標蛋白分子量進行SDS-PAGE電泳分離蛋白（蛋白上樣量為20~30 μg），轉硝酸纖維素膜，用50 g/L脫脂牛奶室溫封閉60 min，一抗（1∶500）4℃孵育過夜，二抗（1∶1 000）室溫孵育 1 h，TBST 洗膜，ECL 法發光，在化學發光影像分析系統檢測抗體信號，利用Image J軟件進行灰度分析，以β-actin作為內參計算蛋白相對表達水平的變化。蛋白表達檢測實驗進行至少3次，給出具有代表性的結果圖。

1.2.7 統計學處理 應用SPSS 14.0軟件進行統計分析，結果采用均數±標準差（±s）表示。首先用方差分析檢驗各組是否有顯著差異，存在顯著差異時采用學生t檢驗分析均數間是否有顯著性差異。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HXJN含藥血清對細胞活力和H2O2誘導細胞損傷的影響 首先檢測不同濃度HXJN含藥血清處理24 h對bEND.3細胞活力的影響。結果如圖1A顯示，2.5%、5%和10%濃度含藥血清對細胞活力無顯著影響，但在20%濃度時可引起細胞活力顯著降低（P<0.01），因此后續實驗選用最高10%濃度進行研究。圖 1B顯示，H2O2作用 3 h可呈濃度依賴性誘導細胞活力降低，表明發生氧化損傷，顯微鏡下觀察在100 μM以上劑量組可見細胞出現明顯的變圓、皺縮、破裂及脫落現象。10%含藥血清預處理24 h可顯著減輕 H2O2對細胞活力的影響（P<0.01），但不能恢復到對照組水平。

2.2 HXJN提取物對H2O2誘導細胞氧化應激損傷的保護作用 檢測HXJN提取物處理24 h對 bEND.3細胞活力的影響，結果如圖 2A所示，HXJN在150、300和 750 μg/mL濃度均可引起細胞活力升高（P<0.01）。圖 2B 顯示，200 μM H2O2作用 3 h 可使細胞活力明顯減低，約為對照組的 40% （P<0.01），表明發生氧化損傷。采用750 μg/mL HXJN提取物預處理 24 h可顯著減輕 H2O2對細胞活力的影響（P<0.01）。300 μM H2O2可使細胞活力減低至約為對照組的 20%（P<0.01），此時HXJN不能減輕 H2O2的損傷作用。

圖1 HXJN含藥血清對bEND.3細胞活力的影響

圖2 HXJN提取物對bEND.3細胞活力的影響

2.3 HXJN誘導細胞中HO-1 mRNA和蛋白表達水平上調 血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）是一種廣泛存在于各種細胞中的具有抗氧化、抗凋亡、抗炎癥等保護作用的重要分子，對于維持細胞氧化還原穩態具有重要意義。圖 3A顯示，750 μg/mL HXJN提取物作用4、8、16 h均可檢測到細胞中HO-1 mRNA表達水平顯著上調（P<0.01）。圖 3B顯示，HXJN提取物作用4、6和8 h可顯著上調 HO-1蛋白的表達（P<0.01），提示其可能與HXJN對細胞的抗氧化損傷作用有關。

圖3 HXJN提取物誘導bEND.3細胞中HO-1的表達

2.4 PI3K/Akt信號通路參與HXJN對 HO-1表達的調控 圖4A顯示，正常血清和含藥血清均可上調ph-Akt蛋白的表達水平，提示Akt被激活。由于血清對Akt蛋白磷酸化具有激活作用，為了去除血清對實驗結果的影響，我們采用HXJN提取物在無血清條件下進一步研究HXJN對Akt磷酸化的影響。結果如圖4B顯示，750 μg/mL HXJN作用于細胞在15 min和30 min時即可檢測到ph-Akt蛋白水平顯著升高。同時，如圖 4C顯示，與 HXJN組相比，應用PI3K抑制劑 LY294002（LY，20 μM）和 Akt抑制劑 perifosine（10 μM）預處理可顯著抑制HXJN對HO-1蛋白表達的上調作用（P<0.01），表明PI3K/Akt信號通路參與HXJN對HO-1表達的調控。

圖4 PI3K/Akt信號通路參與HXJN對HO-1表達的調控

圖5 PI3K/Akt/Nrf2信號通路參與HXJN對HO-1表達的調控

2.5 PI3K/Akt/Nrf2信號通路參與介導HXJN對HO-1表達的調控作用 圖 5A顯示，HXJN提取物作用于細胞后在5 min和15 min即時可檢測到轉錄因子 Nrf2（NF-E2-related factor 2）發生磷酸化，隨后30 min時ph-Nrf2水平基本恢復正常。HXJN作用60 min時可檢測到細胞核中 Nrf2蛋白水平升高，表明其發生了核轉位，提示轉錄活性增強。應用PI3K抑制劑 LY294002（LY，50 μM）預處理細胞可抑制HXJN對Nrf2核轉位的誘導作用。圖5B顯示，HXJN可誘導HO-1 mRNA表達上調，而應用Nrf2抑制劑ML385（10 μM）可顯著抑制 HXJN的誘導作用（P<0.01）。圖5C顯示，HXJN可顯著促進HO-1蛋白表達（P<0.01），而應用ML385可顯著阻斷HXJN對HO-1蛋白表達的促進作用（P<0.01），提示 HXJN可通過轉錄因子Nrf2介導HO-1的表達，而PI3K/Akt/信號調控Nrf2磷酸化和核轉位增強其轉錄活性。

3 討論

活血膠囊（HXJN）具有補氣養血、活血化瘀、理氣安神的功效，近年來臨床常用于氣虛血瘀型心血管病的輔助治療。動物實驗已證明，HXJN對動物AS模型具有抗炎和增強斑塊穩定性的作用，但其藥理學作用和分子機制都尚未完全闡明。盡管以往對黃芪、紅花、赤芍等藥材中主要活性成分的藥理學研究顯示，許多活性單體成分都具有不同程度的抗氧化作用，本研究則通過制備HXJN含藥血清和提取物溶液，直接研究其對H2O2誘導bEND.3細胞氧化損傷模型的保護作用，并對其機制進行研究。

本研究結果顯示，HXJN含藥血清和提取物均對H2O2誘導的細胞氧化損傷具有抑制作用。進一步研究顯示，HXJN可誘導 bEND.3細胞中重要的抗氧化酶HO-1基因和蛋白表達升高，可能是其發揮抗氧化作用的基礎。HO-1是體內最廣泛存在的一種重要的抗氧化防御酶，主要催化血紅素分解代謝成亞鐵、一氧化碳和膽綠素，近年來其功能及調控備受關注，已成為藥物開發的重要靶點[11]。研究表明HO-1不僅在維持細胞內氧化還原的平衡中起著重要的作用，同時還具有抗炎和抗凋亡[12]作用，并在腫瘤預防中發揮重要作用[13]。不過，HO-1的過度表達則可能促進腫瘤的發生發展[14]。正常情況下HO-1在大多數組織內呈低水平表達，可為多種傷害性刺激包括缺氧、細胞因子、H2O2、脂質、NO等誘導表達升高，許多藥物可通過誘導HO-1表達而發揮保護作用。HO-1的重要作用之一是參與血管保護。HO-1的表達升高可以對諸如AS和心肌缺血-再灌注損傷等心血管疾病起防御保護作用[15-16]。因此，本研究為HXJN通過抗氧化作用而發揮心血管系統保護作用提供了依據。

研究顯示在HO-1啟動子序列中存在類似抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）的結合位點，因此其表達受轉錄因子Nrf2調控。Nrf2是細胞氧化應激反應中的關鍵因子，通過誘導調控一系列抗氧化蛋白的組成型和誘導型表達，減輕ROS和親電體引起的細胞損傷，發揮保護作用。Nrf2蛋白在機體的多種組織（如肝、腎、脾、心等）的細胞內廣泛表達，提示這些器官的慢性疾病發病機制可能與Nrf2活性缺乏有關[17]。正常生理狀態下，Nrf2與其抑制蛋白 Keap-1（Kelch-like ECH-associated protein-1）相結合存在于細胞質中，并通過Keap1-Cul3-Rbx依賴的泛素化過程保持平衡而處于非活性狀態。在氧化應激或藥物誘導條件下，Nrf2和/或Keap-1發生磷酸化，Nrf2與Keap-1解離并轉位進入細胞核，在細胞核內積聚并進一步識別、結合抗氧化反應元件ARE，從而啟動受Nrf2調控的抗氧化酶基因轉錄表達[18]。本研究結果可見，應用Nrf2抑制劑可抑制HXJN對HO-1表達的上調，提示Nrf2參與介導HXJN對HO-1表達的調控。Nrf2/HO-1是保護心血管系統對抗氧化損傷的重要途徑[19-20]。我們的研究結果顯示，HXJN可誘導Nrf2磷酸化，亦可促進其向細胞核內轉位，應用Nrf2抑制劑可抑制HO-1的表達，提示HXJN可通過調控Nrf2轉錄活性而誘導HO-1表達，因此這可以部分解釋HXJN對心血管疾病的治療作用。值得注意的是，研究顯示Nrf2可激活人類基因組中500多種基因的轉錄，這些基因大多數具有細胞保護功能。基于以往對疾病動物模型研究，提高Nrf2活性對于許多其他疾病（神經退行性病變、慢性腎病、代謝性疾病、自身免疫性疾病等）具有改善作用[21]，這提示HXJN可能對其他老年性慢性疾病也具有改善作用。

本研究對HXJN激活Nrf2的機制進行進一步研究的結果表明，HXJN可通過誘導Akt磷酸化使之激活。應用PI3K/Akt信號通路抑制劑可抑制HXJN引起的Nrf2核轉位的水平，并且抑制HXJN引起的HO-1表達上調，表明PI3K/Akt信號通路參與了HXJN對Nrf2轉錄活性的調控。但目前的結果尚不能完全排除其它信號途徑如ERK1/2或p38等的作用。

綜上所述，HXJN可激活 bEND.3中 PI3K/Akt/Nrf2信號通路，從而激活下游分子 HO-1的表達，發揮抗氧化作用，抑制內皮功能失調和動脈粥樣硬化進程。除抗氧化作用之外，PI3K/Akt/Nrf2信號通路及HO-1蛋白還與抗炎作用、抗細胞衰老作用密切相關，同時也是細胞自噬的重要信號途徑。盡管多種藥物單體成分對PI3K/Akt/Nrf2信號通路的激活作用已有報告，但采用復方直接研究，活性成分組成與比例更能夠反應其整體作用，為HXJN對AS和冠心病發揮預防和治療作用提供了細胞水平的直接證據。