人參白虎湯證發熱大鼠模型的實驗研究*

張序晴，王志琪，李 賽，周志華，彭 蘭，李耀偉，蒲科婷，叢夢靜

（1.湖南中醫藥大學研究生院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；3.湖南省中藥飲片標準化及功能工程中心，湖南 長沙 410208）

人參白虎湯出自《傷寒論》，主治癥見“傷寒，若吐若下后，……，表里俱熱，……，大渴，……，欲飲水數升者”，即陽明里熱兼有氣津兩傷。雖人參白虎湯解熱作用已被臨床實踐證實，然關于其解熱作用機制研究的報道較少。課題組在前期通過網絡藥理學方法測算了人參促白虎湯解熱作用的可能的免疫學機制[1]，若要開展后續的實驗驗證則需使用相應的動物模型。

中醫學認為苦寒中藥能夠損陰傷津，灌胃苦寒中藥造模符合中醫“下”法致虛的理論[2-3]。目前發熱動物模型中，研究解熱藥物的作用及機制常用腹腔注射LPS復制的大鼠模型[4]，課題組前期研究也發現，大鼠經灌胃大黃芒硝水煎液后再腹腔注射LPS可成功建立腹瀉高熱模型，且大鼠發熱的具體情況與大黃芒硝水煎液的灌胃天數有關[5]。因此本次實驗使用大鼠灌胃 0、1、3、5、7 d的大黃芒硝湯并結合腹腔注射 LPS的方法復制發熱的大鼠模型，并對該模型大鼠的免疫功能進行評價，以期為人參白虎湯證發熱動物模型的研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 Wistar大鼠，SPF級，雄性，25只，體質量170～200 g。由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物合格證號：1100111911002984，許可證號為SCXK（京）2016-0005。本實驗的環境與設施條件符合中國國家標準《實驗動物環境及設施》，動物實驗單位的許可證編號為SYXK（湘）2013-0005。正式實驗前，大鼠于溫度基本恒定（22±2）℃，相對濕度不發生較大改變（55±2）%的實驗環境中適應性飼養3 d（每只大鼠每天喂食1次，每次喂食15 g大鼠飼料，并提供水源）。

1.1.2 藥物 大黃（飲片，湖南橫岳中藥飲片有限公司，批號：19100103）；芒硝（飲片，湖南省宏華中藥飲片有限公司，批號：181204）；LPS（sigma 公司，批號：L-2880）。

1.2 藥液的制備 大黃芒硝湯制備[6]：大黃與芒硝按照4∶3的比例配伍，制備時首先稱取適量大黃放置于1 000 mL圓底燒瓶中，隨后加入10倍量蒸餾水，浸泡30 min。再使用電熱套加熱的冷凝回流裝置，將浸泡過的大黃加熱，至溶液沸騰后并保持微沸狀態15 min。隨后將所制得水煎藥液用紗布（兩層）趁熱過濾，取濾液，并將其趁熱加入裝有已稱好芒硝的燒杯中，邊加熱邊攪拌使芒硝充分溶解。隨即在減壓旋轉蒸發儀中將大黃芒硝水煎藥液進行濃縮，濃縮后所得的藥液中每1 mL應含生藥1.30 g。

LPS溶液制備[7]：將LPS用0.9%氯化鈉注射液進行稀釋，最終配置成 100 μg/mL的LPS溶液。LPS溶液于臨用前新鮮配制。

1.3 動物的分組與造模 經過適應性飼養的Wistar大鼠按體質量分層隨機分為5組，分別為灌胃0 d組、灌胃1 d組、灌胃3 d組、灌胃5 d組、灌胃7 d組，每組5只。各組動物于正式實驗第1天起，每天2次，連續 7 d 定時（早上 8∶30 和晚上 18∶30）進行體溫測定以及灌胃大黃芒硝湯（按照1 mL/100 g體積給藥）。灌胃0 d組連續7 d按上述方法灌胃給予提藥用的超純水；灌胃1 d組按上述方法連續6 d灌胃給予蒸餾水，在實驗第7天灌胃大黃芒硝湯；其余各組以此類推進行灌胃操作。實驗動物于正式實驗第7天前6 h進行禁食，最后一次灌胃大黃芒硝湯后觀察大鼠是否有腹瀉情況產生，出現腹瀉后行腹腔注射LPS溶液1次，給藥劑量為100 μg/kg。

1.4 樣本采集與指標檢測

1.4.1 大鼠的一般狀態 觀察灌胃給藥大黃芒硝湯后各組大鼠的活動以及呼吸頻率、精神狀態、皮毛色澤、糞便稀軟程度等情況。

1.4.2 大鼠體溫的變化 體溫測量方法：將歐姆龍電子體溫計（MC-347）涂上甘油插入大鼠肛門約2 cm處。于正式實驗第7天，在大鼠灌胃給藥大黃芒硝湯的末次，以出現明顯腹瀉為提示，之后每隔30 min測定大鼠體溫1次，共計測定體溫3次，并作為基礎體溫。隨后注射LPS，每隔1 h測定1次體溫，共測定體溫11次。將注射LPS前后體溫進行統計學對比。

1.4.3 生物樣本采集 于正式實驗第7天，末次灌胃后大鼠出現明顯腹瀉時分別收集各組糞便，隨后進行第1次眼眶血樣采集。再注射LPS，待測完最后一次體溫，麻醉大鼠，通過腹主動脈進行第2次采血，并摘取大鼠脾臟。

1.4.4 相關指標檢測 將所采集的大鼠糞便進行稱重，放入烘箱烘干后，再稱重，糞便含水量%=（烘干前質量-烘干后質量）/烘干前重量×100%；將大鼠脾臟稱重并計算脾臟指數：脾臟指數=脾臟質量/大鼠體重×10；采用全自動血液分析儀將兩次采集的血樣進行血細胞計數。

1.4.5 統計學方法 實驗數據采用SPSS21.0統計軟件處理，計量數據均以均數±標準差（±s）表示，多組數據均采用單因素方差分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠的一般狀態 通過觀察發現，隨著灌胃天數的增加，灌胃1、3、5、7 d組大鼠較灌胃0 d組大鼠活動活躍程度出現明顯降低，且飲水量表現出明顯增高。灌胃1、3、5、7 d組大鼠的皮毛較灌胃0 d組大鼠明顯失去光澤，產生糞便明顯更加稀軟。其中灌胃5 d組大鼠產生糞便的稀軟程度較灌胃0、1、3、7 d組更加明顯。

2.2 大鼠各項指標的變化

2.2.1 體溫變化 注射LPS后大鼠的體溫變化見表1。注射LPS 5 h后各組大鼠體溫呈現出明顯升高，隨后繼續升高。直到7 h左右體溫升高達到峰值，且較基礎體溫有顯著的統計學差異（*P<0.05），7 h后各組大鼠體溫開始有下降趨勢。其中灌胃5 d組較灌胃0、1 d組最早出現體溫升高且體溫極值最大，較灌胃0、1、3、7 d組體溫最先升高到極值。

表 1 注射 LPS后 1～10 h各組大鼠體溫（±s，n=5，℃）

表 1 注射 LPS后 1～10 h各組大鼠體溫（±s，n=5，℃）

注：與基礎體溫比較，*P＜0.05

組別0 d基礎體溫 1 h 2 h 3 h 4 h 5 h 6 h 7 h 8 h 9 h 10 h 11 h 37.3±0.19 37.6±0.15 37.4±0.32 37.3±0.4 38.1±0.30 38.0±0.30*38.7±0.21*38.9±0.26*38.7±0.15*38.2±0.29*37.9±0.28*37.6±0.32 1 d 37.6±0.18 37.6±0.14 37.5±0.30 37.7±0.38 38.2±0.38 38.5±0.30*38.7±0.23*38.9±0.32*38.7±0.16*38.7±0.23*38.2±0.16*37.8±0.29 3 d 37.4±0.19 37.4±0.18 37.5±0.20 37.9±0.20*38.2±0.38*38.8±0.34*38.9±0.35*39.3±0.45*38.9±0.33*38.9±0.29*38.7±0.35*37.8±0.26 5 d 37.4±0.17 37.6±0.21 37.3±0.06 38.0±0.12*38.2±0.27*39.2±0.28*39.6±0.29*39.4±0.16*38.9±0.32*38.8±0.29*38.5±0.24*37.9±0.27*7 d 37.4±0.33 37.4±0.29 37.4±0.15 37.9±0.17*38.1±0.35*38.8±0.19*39.4±0.14*39.4±0.14*38.9±0.43*38.8±0.24*38.6±0.42*37.7±0.16

2.2.2 脾臟指數、糞便含水量和血細胞計數 灌胃天數對大鼠脾臟指數以及糞便含水量的影響見表2。與灌胃0 d組比較，灌胃1、3、5、7 d組的脾臟指數均出現明顯下降，糞便含水量均出現升高。其中灌胃5 d組較灌胃0 d組脾臟指數的變化顯著，較其他灌胃組的糞便含水量有明顯升高。

灌胃天數對大鼠血液中各類細胞數目的影響見表3。通過比較注射LPS前后的數據可以發現各組大鼠的白細胞及中性粒細胞數均有增加，淋巴細胞數有所減少。且其中灌胃5 d組的白細胞和中性粒細胞數較灌胃1、3、7 d組明顯增多，而淋巴細胞的數目較灌胃0 d組有明顯減少。

表2 灌胃天數對大鼠脾臟指數以及糞便含水量的影響（±s，n=5）

表2 灌胃天數對大鼠脾臟指數以及糞便含水量的影響（±s，n=5）

注：與灌胃0天組比較，*P＜0.05；與灌胃5天組比較，▲P<0.05

灌胃天數/d檢測指標0 1 3 5 7脾臟指數 0.31±0.003▲ 0.28±0.005*▲ 0.26±0.002*▲ 0.22±0.001* 0.23±0.003*糞便含水量%49.4±8.74▲ 69.0±9.01*▲ 85.0±0.38*▲ 91.4±2.92* 82.6±2.49*▲

表3 灌胃天數對大鼠血液中各類細胞數目的影響（±s，n=5）

表3 灌胃天數對大鼠血液中各類細胞數目的影響（±s，n=5）

注：與灌胃0天組比較，*P＜0.05；與灌胃5天組比較，▲P<0.05

注射LPS前注射LPS后0 1 3 5 7 0 1 3 5 7中性粒細胞數 5.2±0.43 5.8±1.02 5.6±1.50 5.1±1.23 5.9±1.02 7.2±0.90▲ 8.0±0.44▲ 10.2±2.40*▲ 18.5±3.82*12.8±1.4*▲白細胞數淋巴細胞9.8±0.69 10.4±2.83 10.2±4.53 10.8±2.1910.8±1.3112.8±1.70▲ 13.8±1.06*▲ 13.7±2.04*▲ 21.4±0.99*15.9±2.65*▲6.5±0.74▲ 5.9±0.69▲ 4.5±0.56*4.1±1.69*4.9±0.78*6.17±1.05▲ 6.1±0.16▲ 4.8±0.32* 4.6±0.41*4.8±0.87*

分析以上數據發現，灌胃5 d組大鼠注射LPS后升溫潛伏期最短，且升溫達到極值時間最短，體溫極值最大，其糞便含水量最高。在血液中的各類細胞的數目中灌胃5 d組大鼠較其他灌胃組的白細胞和中性粒細胞明顯增加，淋巴細胞的數目同灌胃0 d組相比明顯減少。

3 討論

高熱是多種臨床疾病中常見的表現形式，并且由高熱所致的體征（如體溫調節紊亂、體質減弱等）變化，往往對應著不同的發熱機理[8]?，F有關于解熱藥物的治療機理研究以及發熱大鼠模型的建立大多基于現代醫學理論，基于中醫藥理論對解熱藥機理的研究，及針對中醫熱證的模型并不多見[9]。已有虛熱證動物模型的造模往往采用給大鼠灌胃熱性中藥（多為復方）合并腹腔注射致熱藥物和激素類藥物或高強度運動的方法，致使大鼠陰液大損[10-12]。

人參白虎湯證屬中醫氣分熱證之陽明病，系體內陰陽調節紊亂，熱氣盛盈，邪熱未被完全從體內清除，表現為氣陰大傷，治療宜清熱、滋陰，補益[13]?！秱摗分嘘P于人參白虎湯的原文為“傷寒，若吐若下后，七八日不解，熱結在里，表里俱熱，時時惡風，大渴，舌上干燥而煩，欲飲水數升者，白虎加人參湯主之”，提示如應用中醫的“下”法引起體虛再結合LPS復制發熱動物模型很可能符合人參白虎湯證。中醫認為苦寒中藥能夠損陰傷津，灌胃苦寒中藥造模符合中醫“下”法致虛的理論。現大多數研究使用的腹腔注射LPS致熱也是制備發熱模型的經典方法。氣血津液虧損導致的體虛與免疫有著高度相關性[14]，發熱與天然免疫及炎癥反應密切相關[15-16]，故炎癥和免疫功能的相關指標可作為評價體虛高熱模型的指標之一。

在炎癥發生的過程中，中性粒細胞會通過一系列聯級反應來對抗人體中出現的炎癥，從而起到維持人體的機體穩態平衡。而白細胞在抑制炎癥方面起著至關重要的調節解作用。因此當炎癥反應發生時，中性粒細胞的數目與白細胞數目均會有所提升[17-18]。淋巴細胞則是免疫系統中重要的細胞，可以起到對免疫的調節作用，當免疫功能急劇減弱時會出現淋巴細胞的減少[19]。同樣在免疫功能中起著重要作用的還有脾臟這一臟器，當免疫功能低下的時候脾臟指數也會隨之下降[20-21]。

實驗的體溫變化與糞便含水量數據顯示，灌胃大黃芒硝湯的天數對發熱及腹瀉程度有影響，且灌胃5 d組的腹瀉發熱效果最好。實驗結果也表明白細胞與中性粒細胞的數目同腹腔注射LPS所致的發熱密切相關，具體表現為腹腔注射LPS后白細胞和中性粒細胞的數目增加；而脾臟指數與淋巴細胞的數目則同灌胃大黃芒硝湯后所致的體虛有關，且灌胃大黃芒硝湯天數不同，脾臟指數和淋巴細胞的減少也有所不同。其中灌胃5 d組白細胞與中性粒細胞數以及脾臟指數和淋巴細胞數的變化均是最為顯著的，且具有統計學意義。

中醫藥實驗研究中，復制方證動物模型是難點之一。本次實驗研究發現，灌胃苦寒性瀉下中藥大黃芒硝湯結合注射LPS可以成功建立體虛高熱模型，其脾臟指數與各類血細胞計數是體虛高熱動物模型免疫功能的評價的重要指標。從統計學差異比較中可以得出灌胃5 d組可以建立出更為理想的體虛高熱大鼠模型，也更符合人參白虎湯證。該模型的建立可為人參白虎湯解熱機理的實驗研究提供基礎。