苦參查爾酮異構(gòu)酶的基因克隆與表達分析*

易雨琪，韓榮春，俞年軍，顧 曉，蘇 蝶，童小慧，許 菲，王麗萍

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥資源保護與開發(fā)研究所，安徽 合肥 230012）

苦參始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]：“味極苦，性寒”，為豆科植物苦參（Sophora flavescens Ait.）的干燥根，主產(chǎn)于我國河北河南地區(qū)；有清熱燥濕、殺蟲解毒、利水消腫之功，用于皮膚瘙癢、黃疸、熱痢及濕疹等癥[2]。苦參主要含有黃酮類、黃酮醇類、生物堿類和三萜類等多種化學(xué)成分。其中黃酮類主要包括大豆苷元、柚皮素、苦參酮、異苦參酮等；生物堿類成分主要是喹諾里西啶類，少數(shù)為雙哌啶類成分，其主要包括苦參堿、氧化苦參堿、羥基苦參堿等[3-5]。現(xiàn)代藥理藥效學(xué)研究表明，苦參具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗肝損傷和抑制中樞等藥理活性，其藥理活性成分主要包括生物堿及黃酮類化合物[6-9]。

查爾酮異構(gòu)酶（Chalcone isomerase，CHI）是黃酮類物質(zhì)生物合成過程中的關(guān)鍵酶[10-12]。該酶首先發(fā)現(xiàn)于植物中，可將查爾酮環(huán)化為黃烷酮類物質(zhì)。隨后在真菌、黏菌和變形菌基因組中均發(fā)現(xiàn)了查爾酮的同源基因，該類生物體中因缺乏相關(guān)的催化底物，故認(rèn)為CHI無法發(fā)揮作用[13]。目前最新研究報道顯示，啤酒花中無催化活性的CHI蛋白對其黃酮類化合物的生物合成起重要的促進作用[14]。查爾酮異構(gòu)酶的基因克隆及表達分析在草莓果實[15]、杭菊[16]、紫丁香[17]等植物中已有報道。有鑒于CHI在生物界分布的特點及其可不依賴于直接催化作用而影響特定次生代謝產(chǎn)物合成與積累的性質(zhì)，通過對sfCHI的研究可以為苦參黃酮與花青素類物質(zhì)生物合成研究提供資料，同時也為系統(tǒng)研究CHI進化與分子機理積累素材。

1 材料與方法

1.1 材料 苦參植物采自安徽中醫(yī)藥大學(xué)種質(zhì)資源圃，經(jīng)俞年軍教授鑒定為豆科植物苦參Sophora flavescens Ait.。選擇二年生苦參植株，自來水洗凈后以75%乙醇消毒，再用無菌水沖洗3次后，在Kimwiper無塵紙上吸干水分備用。選取苦參新鮮植株，分為根、莖、葉和葉柄4個部位，將新鮮組織及時用液氮在研缽中研磨成細(xì)粉后保存在-80℃冰箱，用于提取苦參不同部位的總RNA。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA的合成 選用Trizol試劑盒（Life Technologies，美國）提取苦參不同部位凍存粉末中的總RNA后，以ScanDrop 200型核酸分析儀（Jena，德國）對核酸進行檢測以保證OD260/280＞1.80，OD260/230＞1.80。所有樣品的總RNA各使用1 000 ng，以 FastQuant RT試劑盒（天根，北京）完成RNA的反轉(zhuǎn)錄，得到第一鏈cDNA。

1.2.2 引物設(shè)計及sfCHI序列信息驗證 基于本課題組前期研究結(jié)果，通過Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）程序?qū)⒖鄥⑥D(zhuǎn)錄本Unigenes[18]在NCBI nr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進行檢索，推送檢索得到的序列信息至UniProt數(shù)據(jù)庫[19]以注釋sfCHI的同源序列。用Primer-BLAST程序在線設(shè)計引物進行特異PCR反應(yīng)。本實驗引物及質(zhì)粒測序服務(wù)均由生工生物工程上海股份有限公司提供，各引物信息見表1。

表1 苦參sfCHI基因克隆與PCR實驗所用引物信息

將sfCHI的PCR擴增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳分離后，在紫外光下將條帶自凝膠中切出。使用Promega瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒回收DNA后，使用pGM-T Fast克隆試劑盒（天根，北京）將sfCHI與載體連接。使用熱休克方法將含有外源基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α后，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。通過Invitrogen質(zhì)粒提取試劑盒回收質(zhì)粒后進行測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 選擇具有代表性的同源序列與sfCHI進行比較分析，采用MEGA X[20]軟件的鄰位相連法參數(shù)構(gòu)建其系統(tǒng)進化樹。同時針對sfCHI所編碼的氨基酸序列進行理化特征分析（http：//web.expasy.org/protparam）以及三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測（http：//www.reading.bioinf）。

1.2.4 苦參sfCHI不同組織間表達的半定量PCR分析 作為參照，以苦參的β-actin作為管家基因。使用表1的β-actin_F、β-actin_R、sfCHI_F與sfCHI_R引物對苦參根、莖、葉片、葉柄共4個部位進行PCR擴增。結(jié)合前期實驗的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分別考察β-actin在苦參不同器官及不同采集時間的表達穩(wěn)定性[18]；設(shè)置PCR不同循環(huán)次數(shù)，分析sfCHI的電泳條帶亮度和器官間表達差異，優(yōu)化反應(yīng)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦參sfCHI的基因克隆 基于苦參轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，使用sfCHI引物對擴增莖和葉cDNA，以7 μL擴增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳，電泳結(jié)果如圖1所示，擴增產(chǎn)物長度與預(yù)期一致。經(jīng)凝膠回收、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與大腸桿菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取與測序組裝后，使用NCBI BLAST進行同源基因檢索，發(fā)現(xiàn)sfCHI與豆科狹葉羽扇豆（Lupinus angustifolius）CHI序列一致性為 89.95%，與月季 CHI（Rosa chinensis）相似度為78.47%。sfCHI基因長度為630 bp，編碼氨基酸209個。該基因在DDBJ的登錄序列號為LC495308。sfCHI基因的cDNA核酸及氨基酸序列見圖2。

圖1 苦參CHI基因PCR擴增結(jié)果

圖2 苦參CHI基因cDNA及氨基酸序列

2.2 苦參CHI基因所編碼蛋白質(zhì)預(yù)測 采用瑞士生物信息研究所ProtParam軟件對sfCHI蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進行解析預(yù)測：其蛋白質(zhì)分子式為C1062H1661N259O326S2，由20種共209個氨基酸構(gòu)成；sfCHI的原子總數(shù)為3 310，分子量為23 337.53；推算其不穩(wěn)定系數(shù)為34.04，屬穩(wěn)定型蛋白質(zhì)；其預(yù)估半衰期在哺乳動物網(wǎng)狀紅細(xì)胞（體外）內(nèi)為30 h、酵母菌（體內(nèi)）超過 20 h、大腸桿菌（體內(nèi)）超過10h；脂肪質(zhì)指數(shù)為94.69。使用英國雷丁大學(xué)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測服務(wù)器（IntFOLD ver5.0）[21-22]對sfCHI進行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測，蛋白質(zhì)模板選擇PDB數(shù)據(jù)庫的 4dokA、4doiA和 1eyqA（見圖 3）；結(jié)果顯示sfCHI的3D結(jié)構(gòu)預(yù)測P值為2.92E-9，提示該結(jié)構(gòu)預(yù)測的可信度較強。

圖3 苦參CHI蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

2.3 苦參CHI基因同源性及進化分析 對包括sfCHI在內(nèi)的5種植物的CHI氨基酸序列進行同源分析，序列多重比對使用ESPript ver3.0軟件。結(jié)果提示，該組植物查爾酮異構(gòu)酶間存在較高的相似性（見圖4）。將sfCHI的核酸序列通過NCBI BLASTx進行檢索（E值設(shè)置為1e-10），在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中共檢索到576條結(jié)果；其中與sfCHI序列一致性最低的為可可樹（Theobroma cacao，25.95%）；最高的為狹葉羽扇豆（Lupinus angustifolius，89.95%）。以包含 sfCHI編碼蛋白在內(nèi)的16種不同植物CHI氨基酸序列為模板，采用MEGA X軟件創(chuàng)建CHI系統(tǒng)進化樹（見圖5），以鄰位相連（Neighbor-joining）為統(tǒng)計方法，替代模型使用泊松分布，輔以配對刪除法對缺失數(shù)據(jù)進行處理。結(jié)果顯示，4種豆科植物的遺傳距離較近，而擬南芥、水稻等模式植物的遺傳距離相對較遠(yuǎn)；這與傳統(tǒng)分類學(xué)結(jié)論相一致。

圖4 不同植物CHI氨基酸序列多重比對

圖5 苦參CHI系統(tǒng)進化樹

2.4 半定量表達分析 將PCR退火溫度設(shè)為50℃，每次循環(huán)延伸時間為1min；β-actin凝膠電泳圖在26循環(huán)時可見明顯條帶且苦參不同采集月份的PCR擴增圖譜在4種組織間無明顯差異，提示管家基因的表達較穩(wěn)定。經(jīng)預(yù)實驗考察，對sfCHI的半定量擴增循環(huán)次數(shù)分別定為28、30。見圖6。

圖6 苦參CHI基因在不同組織中的相對表達量

3 討論

本實驗通過分析苦參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[18]，設(shè)計特異性引物對sfCHI進行克隆。經(jīng)凝膠回收、載體連接與轉(zhuǎn)化，在質(zhì)粒提取后進行測序，確定了sfCHI序列的堿基數(shù)為630 bp，編碼209個氨基酸。對sfCHI翻譯的蛋白質(zhì)進行測算，發(fā)現(xiàn)其理化性質(zhì)較為穩(wěn)定，在酵母等模式工程菌體內(nèi)可存在較長時間，適合進行原核或真核異源表達。將sfCHI在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索同源序列，發(fā)現(xiàn)其與數(shù)種豆科植物的CHI相似性較高，而與水稻等同源性較低。基于前期轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)[18]關(guān)于苦參CHI的組織間表達情況，sfCHI的RPKM值在根、莖、葉和葉柄中分別為 2、97.4、130.9 和 112.7；采用半定量PCR法對sfCHI基因表達信息進行分析，發(fā)現(xiàn)實測情況與生物信息學(xué)數(shù)據(jù)吻合度較高。通過本研究明確sfCHI序列信息、理化特征與基因表達信息，將對進一步研究苦參黃酮類物質(zhì)生物合成機制起到積極的推動作用。