高效液相色譜法同時(shí)測定舒筋活血片中5種成分

郭 婭，王文婷，袁 林

（重慶市萬州食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 404000）

舒筋活血片是由紅花、醋香附、香加皮、狗脊和槲寄生等10味中藥組方的中藥制劑，可用于筋骨疼痛、活血散瘀［1-5］，收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第十三冊）》［6］。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中舒筋活血片的含量檢測以4-甲氧基水楊醛為指標(biāo)成分，僅檢測香加皮中有效成分的含量，但單一成分的檢測不能完整、充分地反映和體現(xiàn)藥物的內(nèi)在質(zhì)量。目前，關(guān)于測定舒筋活血片中其他成分含量的研究已有報(bào)道［7-14］。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測定舒筋活血片中4-甲氧基水楊醛、α-香附酮、原兒茶酸、羥基紅花黃色素A和山柰素5種成分的含量。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（安捷倫公司），包括紫外檢測器；AB204S型分析天平（萬分之一，梅特勒公司），MSE225S型分析天平（十萬分之一，賽多利斯公司）。

1.2 試藥

4-甲氧基水楊醛對(duì)照品（批號(hào)為110790-201404，純度為99.0%），α-香附酮對(duì)照品（批號(hào)為110709-201111，純度為 99.3% ），原兒茶酸對(duì)照品（批號(hào)為110810-201007，純度為 98.2%），羥基紅花黃色素 A對(duì)照品（批號(hào)為 111637-201308，純度為 96.5%），山柰素對(duì)照品（批號(hào)為 110861-201301，純度為 93.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院；舒筋活血片（重慶天致藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為180401；河南省百泉制藥有限公司，批號(hào)為171125；三門峽廣宇生物制藥有限公司，批號(hào)為201802）；甲醇為色譜純，冰醋酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.7%醋酸溶液（A）- 甲醇（B），梯度洗脫（0～13 min，30%A，70%B；13～25 min，30%A→80%A，70%B→20%B；25～40 min，80%A，20%B）；檢測波長：254 nm；流速：1.0 mL ／min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

取4-甲氧基水楊醛、α-香附酮、原兒茶酸、羥基紅花黃色素A和山柰素對(duì)照品，精密稱定，加70%甲醇制 成質(zhì)量濃度分 別為 239.4，527.2，268.2，292.6，103.6 μg／mL的對(duì)照品貯備溶液。分別精密量取上述貯備溶液各2.0 mL置同一25 mL容量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。取樣品20片，研細(xì)，混勻，取約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為500 W，頻率為 40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。取缺少香加皮、香附、狗脊和紅花的陰性樣品，按供試品溶液項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別吸取2.2項(xiàng)下3種溶液各適量，精密稱定，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析。色譜圖見圖1。可見，5種被測成分分離完全，陰性對(duì)照無干擾，專屬性良好。

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2項(xiàng)下5種對(duì)照品貯備溶液 0.2，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，10.0 mL，置 25 mL容量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列混合對(duì)照溶液。按擬訂色譜條件進(jìn)樣，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

精密度試驗(yàn)：按擬訂色譜條件，取混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果4-甲氧基水楊醛、α-香附酮、原兒茶酸、羥基紅花黃色素A和山柰素的RSD分別為 0.06% ，0.10% ，0.22% ，0.69% ，0.35%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液（批號(hào)為180401），分別于 0，2，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果 4-甲氧基水楊醛、α-香附酮、原兒茶酸、羥基紅花黃色素A 和山柰素的RSD分別為 0.56% ，1.27%，0.98%，0.99%，1.08%（n＝6），表明供試品溶液中 5 種成分在70%甲醇中24 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 高效液相色譜圖

表1 5種成分線性回歸方程和線性范圍

重復(fù)性試驗(yàn)：平行制備供試品溶液6份，進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果4-甲氧基水楊醛、α-香附酮、原兒茶酸、羥基紅花黃色素A和山柰素的RSD分別為0.92%，2.19%，1.64%，0.64% ，0.91% （n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為180401）6份，每份約1.0 g，精密稱定，分別按樣品含量-對(duì)照品（1∶1）的比例加入一定量的對(duì)照品溶液，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

2.4 樣品含量測定

取3批樣品各約2.0 g，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，以外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 提取條件優(yōu)化

通過單因素試驗(yàn)考察，對(duì)提取溶劑（甲醇、70%甲醇和50%甲醇）、提取方法（超聲、回流）和提取時(shí)間（20，30，40 min）進(jìn)行比較，結(jié)果表明，用70%甲醇超聲處理30 min為最優(yōu)提取條件。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表3 3批樣品含量測定結(jié)果（mg／g，n＝3）

3.2 色譜條件優(yōu)化

曾比較檢測波長（254，300，360 nm）、0.7% 醋酸溶液 -甲醇比例（10 ∶90，20 ∶80，30 ∶70）、不同比例的醋酸溶液（0.2% ，0.5% ，0.7% ）對(duì)試驗(yàn)的影響，結(jié)果表明，當(dāng)檢測波長為254 nm，醋酸溶液體積分?jǐn)?shù)為0.7%，且與甲醇比例為30∶70時(shí)，色譜峰峰形和分離度最佳。

3.3 研究價(jià)值

舒筋活血片目前尚未列入2015年版《中國藥典》，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-2624-97-2011。其含量檢測中以4-甲氧基水楊醛為指標(biāo)成分，僅檢測香加皮中有效成分的含量，但單一成分的檢測不能完整、充分地反映和體現(xiàn)藥物的質(zhì)量，本研究中以舒筋活血片為對(duì)象，采用HPLC法同時(shí)測定其中4-甲氧基水楊醛、α-香附酮、原兒茶酸、羥基紅花黃色素A和山柰素5種成分的含量。結(jié)果表明，各成分在40 min內(nèi)檢測完全，方法精密度、重復(fù)性、準(zhǔn)確度均良好，可用于檢測不同批次的樣品，對(duì)舒筋活血片的多成分含量測定和質(zhì)量控制提供了參考。