艾灸促進壓力性損傷組織血管新生的機制研究

于杰，孫忠人，李洪玲，趙惠

壓力性損傷（又稱席瘡、壓瘡）是由于局部組織長期受壓，繼而發生持續缺血、缺氧以及營養不良，致使組織發生潰爛、壞死的外科疾患?，F代醫學認為壓力性損傷屬于慢性、難愈性創面，具有缺乏微血管數量、組織低氧血癥、缺乏相關修復因子及上皮化延遲等特點，壓力性損傷一旦形成后將面臨創面難以愈合的問題［1-5］。艾灸可以促進壓力性損傷創面組織的愈合，療效確切，但其作用機制還不完全清楚，因此探索艾灸治療本病的作用機制尤為重要［1］。本課題組利用免疫組化技術從蛋白層面對RAS/RAF/ERK 信號通路中的關鍵信號分子進行檢測，旨在為探討艾灸促進壓力性損傷愈合、血管新生的作用及可能存在的分子機制提供療效保障，為皮膚壓力性損傷乃至慢性損傷組織的機制研究、修復及愈合相關研究提供重要理論和實驗依據［1-5］。

本文創新點：

（1）從祖國醫學特色理論層面分析，艾灸治療壓力性損傷切中要害。艾灸治療本病，不僅能夠扶助正氣，提高機體的免疫力，而且具有殺菌祛邪的作用。艾灸行氣活血，通經活絡，促進氣血運行，氣機通暢，營衛調和，故瘀結自散，其體現了鮮明的中醫原創特色。（2）從現代醫學研究前沿角度分析，血管內皮生長因子（VEGF）/血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）信號通路是壓力性損傷組織血管新生的重要理論成果與熱點之一，其主要調控形成新生血管的血管內皮細胞的增殖和其通透性的改變等。通過國內外權威文獻檢索，發現迄今尚未有基于VEGF/VEGFR2 信號通路的艾灸促進壓力性損傷組織血管新生的研究報道。（3）鑒于其學術重要性與臨床指導意義，本課題以“艾灸促進壓力性損傷組織血管新生”為切入點，以VEGF/VEGFR2信號通路為核心，運用祖國醫學原創理論中的艾灸“行氣活血，通經活絡”治則，優化影響其療效發揮的相關因素，采用經改良及優化的壓力性損傷缺血-再灌注損傷大鼠模型，通過免疫組化從蛋白層面檢測RAS/RAF/ERK 信號通路中關鍵信號分子的表達，深入研究艾灸促進壓力性損傷組織血管新生的分子調控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2015 年12 月—2017 年3 月對120 只體質量為230～245 g 的清潔級健康雌性SD 大鼠（系黑龍江中醫藥大學動物實驗中心）給予單籠喂養，自由飲水、進食并活動［1-3］。在40%～50%相對濕度、溫度（19.0±2.1）℃、明暗周期12 h的環境中進行適應性喂養14 d 后選取85 只給予造模處理，另35 只作為空白組，對實驗動物的處置符合動物實驗倫理標準。

1.2 主要儀器及試劑 儀器：DHP-9082 型電熱恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司），RM2235 型切片機、EG1160 組織包埋機、DM4000B 顯微鏡、HI1220 烘片機（德國LEICA 公司），醫用微波爐（青島海爾）。包埋盒（世泰實驗耗材有限公司），電動理發器（寧波真漢子電器有限公司），壓力性損傷造模裝置（規格厚度為1.5 cm 有機玻璃板、純凈水瓶底座、十字形托盤、不銹鋼絲網、502 膠水、膨脹螺絲、帆布條、鋼珠、塑料制尼龍扎帶），非接觸式電子溫度計（廣州市金鑫寶電子有限公司），電子天平（MP200A 型，上海精密儀器廠）。試劑：五年陳艾（有煙艾條，規格18 mm×200 mm，南陽藥益寶艾草制品有限公司）、醫用碘伏，敏感肌膚型薇婷牌脫毛膏（利潔時家化中國有限公司），醫用酒精，醫用棉簽，0.9%氯化鈉溶液，定性濾紙1001-6508，水合氯醛。磷酸鹽緩沖液（PBS）（SLB-P1010-2、solarbio），蘇木素染液（上海碧云天生物技術有限公司），無水乙醇、石蠟、二甲苯，BSA 封閉液（SLB-SW3015、solarbio），蒸餾 水，Anti-VEGFA 抗 體（VG-1） （ab1316、ABCAM），Phospho-p44/42 MAPK （ERK1/2） （Thr202/Tyr204） （D13.14.4E）XP ? Rabbit mAb（#4370、Cell Signaling Technology），KRAS Polyclonal Antibody（12063-1-AP、Proteintech） 以及抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒（Proteintech）。

1.3 壓力性損傷動物模型的制備 分別用塑料制尼龍扎帶將大鼠四個部位固定（腹部、雙側腋下、雙側踝部、雙側腹股溝內側），充分暴露造模部位后備皮（備皮長寬均為20 mm），消毒待造模處及螺釘錐度側。將造模裝置固定于大鼠腿部近膝關節骨隆突處（即造模處），通過缺血-再灌注損傷循環周期模式制備壓力性損傷動物模型。1 個循環=缺血期（120 min）+再灌注期（30 min），5 個循環/d，持續3 d。30 min 的再灌注期解壓松綁大鼠，任其活動、飲水及進食。造模3 d 后，持續1 d 的觀察期，用以評價模型制備的成功與否，并剔除制備失敗的動物模型［2-3］。動物模型的評價參照2～3 期壓力性損傷（即2016 年NPUAP 公布的最新指南）［6］，并進行肉眼（創面顏色、形態及滲出物性質）及行為學（大鼠整體狀態、性情、步態及二便等）的觀察［7］。

1.4 實驗分組及干預治療 遵循先造模后隨機的原則，進行壓力性損傷缺血-再灌注模型制備。85 只大鼠中，造模過程中死亡9 只，造模失敗6 只。將造模成功的70 只大鼠采用隨機數字表法分為模型組和艾灸組，35 只/組；造模后至干預過程中模型組和艾灸組各有5 只大鼠脫落。另35 只大鼠作為空白組，其中5 只大鼠于備皮時出現負損傷而給予剔除。3 組動物捆綁方式均相同，即對大鼠腹部、雙側腋下、雙側踝部、雙側腹股溝內側四個部位通過塑料制尼龍扎帶捆綁固定于不銹鋼絲網上?？瞻捉M不予造模，僅對模擬造模部位處進行碘伏處理。模型組僅對創面進行碘伏常規處理，艾灸組先對創面予碘伏處理，繼予艾灸回旋灸操作，以壓力性損傷創面為中心，10 mm 為半徑，1 次/d，15 min/次。將艾條燃燒端及非接觸式電子溫度儀探頭與壓力性損傷創面的距離控制在30 mm左右，將艾灸溫度控制在40～42℃，每30 s 測量1 次溫度，全程施灸操作需注意對艾條燃燒過程中產生的灰燼及時處理，旨在達到艾灸療效最佳化與負損傷最小化。

1.5 標本采集 分別將模型組和艾灸組大鼠于治療第1、3、5、7、10 天進行標本采集，空白組大鼠隨同以上兩組于上述5 個時間點取材處理（3 組每個時間點各選6 只大鼠進行處理）。標本采集前測定所有大鼠體質量，根據體質量不同分別給予對應的水合氯醛進行腹腔注射麻醉，取材區域為以壓力性損傷創面正中心為圓點、5 mm 為半徑的皮膚全層組織。取材過程中注意勿將組織打卷，展平固定在濾紙中，置于包埋盒中，貯存在盛有10%的中性甲醛溶液，24 h 內進行包埋處理，標本采集后所有大鼠脫頸椎處死。

1.6 免疫組化操作步驟 （1）酒精梯度脫水：60%乙醇溶液浸泡30 min →80%乙醇溶液浸泡30 min →95%乙醇溶液浸泡30 min →100%乙醇Ⅰ浸泡30 min →100%乙醇Ⅱ浸泡30 min。（2）透明：在二甲苯與酒精等量混合溶液中浸泡15 min →二甲苯浸泡30 min。（3）浸蠟：在石蠟和二甲苯等量混合溶液中浸泡15 min→石蠟Ⅰ30min→石蠟Ⅱ 30 min。（4）包埋：將浸蠟后的皮膚組織依次包埋成塊。（5）切片：切片厚度≤4 μm，烘烤60 min。（6）脫蠟及水化：二甲苯脫蠟處理，將切片置于二甲苯中浸泡10 min，共進行2 次→在無水乙醇中浸泡1 min，共進行3 次→在95%乙醇溶液中浸泡2 min →在85%乙醇溶液中浸泡2 min →在75%乙醇溶液中浸泡2 min →蒸餾水沖洗2 min，共進行3 次。（7）抗原修復：室溫下進行3%過氧化氫滅活處理→蒸餾水沖洗2 min，共進行3 次→浸入枸櫞酸鹽緩沖液（pH 值為6.0）→微波爐加熱98 ℃，至沸騰狀態→自然冷卻至室溫20 min →PBS 沖洗1 min，共進行3 次→用油性筆畫出加抗體的范圍，一般超過組織3 mm。（8）封固：滴加5%BSA 封固液，在室溫狀態下封固60 min，將多余的液體甩掉，不洗。（9）孵育一抗：滴加經過稀釋后的一抗，4 ℃恒溫過夜→取出后于室溫狀態下復溫20 min → PBS 沖洗2 min，共進行3 次。（10）孵育二抗：滴加經過稀釋后的二抗→37 ℃孵育30 min →PBS 沖洗2 min，共進行3 次。（11）DAB 顯色：DAB 顯色1 min →室溫顯色→鏡下觀測顯色結果，終止顯色→蒸餾水沖洗。（12）復染：蘇木素復染1 min →流水沖洗干凈，沖反面→鹽酸酒精分化3 s →流水沖洗返藍10 min。（13）脫水、透明及封固：在75%乙醇溶液中浸泡2 min →在85%乙醇溶液中浸泡2 min →在95%乙醇溶液中浸泡2 min →在無水乙醇中浸泡1 min，共進行2 次→置于二甲苯中浸泡5 min，共進行2 次→給予中性樹膠封固→顯微鏡下觀察。

1.7 讀片及結果判定 采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件，設置圖像采集系統在同一參數狀態，于400 倍光學顯微鏡下進行拍攝切片，以胞質及細胞核出現棕黃色顆粒為陽性，每張切片隨機選取5 個未重疊的視野，取均值。對血管內皮生長因子（VEGF）、RAS、磷酸化細胞外調節蛋白激酶（P-ERK1/2）的陽性表達進行半定量分析，標準化到每100μm2積分光密度值（IOD），即（IOD 值）/100 μm2。

1.8 統計學方法 采用SPSS 21.0 軟件進行統計學分析。正態分布計量資料以（±s）表示，組間比較采用ANOVA 檢驗，多重比較采用LSD 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 光學顯微鏡下VEGF 表達情況 400 倍高倍鏡下可見，VEGF 在壓力性損傷皮膚組織中的陽性表達部位位于胞質中，在上皮細胞、巨噬細胞中均有表達。VEGF 在正常大鼠皮膚組織中呈弱陽性表達，于空白組各個時間點均呈弱陽性表達狀態。當壓力性損傷出現后，創面組織中VEGF 蛋白表達逐漸升高，而后降低，向正常皮膚組織表達水平回落。艾灸組與模型組兩組組內VEGF蛋白均呈現先升高后降低的表達趨勢，但兩組組內表達高峰值存在區別，艾灸組組內高峰值出現在治療3 d 后，而模型組組內高峰值出現在碘伏處理5 d 后（見圖1）。

2.2 光學顯微鏡下RAS 表達情況 實驗結果顯示，400 倍高倍鏡下可見，RAS 蛋白在壓力性損傷皮膚組織中的陽性表達部位位于胞質中。當損傷出現后，創面組織中RAS 蛋白表達較正常組織呈現先降低，而后升高的表達狀態。艾灸組與模型組兩組組內RAS 蛋白均呈現逐漸升高趨勢（見圖2）。

2.3 光學顯微鏡下P-ERK1/2 表達情況 實驗結果顯示，400倍高倍鏡下可見，P-ERK1/2 蛋白在壓力性損傷皮膚組織中的陽性表達部位位于胞質中。當壓力性損傷出現后，創面組織中P-ERK1/2 蛋白表達逐漸升高，再降低，向正常皮膚組織表達水平回落。艾灸組與模型組兩組組內P-ERK1/2 蛋白均呈現先升高后降低的表達趨勢，但兩組組內表達高峰值存在區別，艾灸組組內高峰值出現在治療3 d 后，而模型組組內高峰值出現在碘伏處理5d 后（見圖3）。

圖13 組大鼠不同時間點壓力性損傷創面組織中VEGF 表達情況（×400）Figure 1 Expression of VEGF protein on the wound surface in 3 groups of rats with pressure injuries at different time-points

2.4 VEGF 表達水平 第1、3、5、7、10 天模型組壓力性損傷創面組織中VEGF 表達水平高于空白組，差異有統計學意義（P＜0.05）；第3、5 天艾灸組壓力性損傷創面組織中VEGF 表達水平高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

2.5 RAS 表達水平 第1、3、5、7、10 天模型組壓力性損傷創面組織中RAS 表達水平低于空白組，差異有統計學意義（P＜0.05）；第3、5、7、10 天艾灸組壓力性損傷創面組織中RAS 表達水平高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

2.6 P-ERK1/2 表達水平 第3、5、7、10 天，模型組壓力性損傷創面組織中P-ERK1/2 表達水平高于空白組，差異有統計學意義（P＜0.05）；第3、5 天艾灸組壓力性損傷創面組織中P-ERK1/2 表達水平高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表3）。

表13 組大鼠不同時間點壓力性損傷創面組織中VEGF 表達水平比較（±s，n=6）Table 1 Comparisons of expression levels of VEGF protein on the wound surface in 3 groups of rats with pressure injuries at different time-points

表13 組大鼠不同時間點壓力性損傷創面組織中VEGF 表達水平比較（±s，n=6）Table 1 Comparisons of expression levels of VEGF protein on the wound surface in 3 groups of rats with pressure injuries at different time-points

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 第1 天 第3 天 第5 天 第7 天 第10 天空白組 9.53±1.44 8.37±0.80 9.20±1.08 8.83±1.10 9.61±0.99模型組 13.11±1.74a 29.17±3.24a 38.66±4.78a 35.37±5.39a 20.61±2.92a艾灸組 14.58±1.6466.42±7.86b 61.10±8.35b 34.96±4.5518.61±2.21

表23 組大鼠不同時間點壓力性損傷創面組織中RAS 表達水平比較（±s，n=6）Table 2 Comparisons of expression levels of RAS protein on the wound surface in 3 groups of rats with pressure injuries at different time-points

表23 組大鼠不同時間點壓力性損傷創面組織中RAS 表達水平比較（±s，n=6）Table 2 Comparisons of expression levels of RAS protein on the wound surface in 3 groups of rats with pressure injuries at different time-points

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 第1 天 第3 天 第5 天 第7 天 第10 天空白組 43.14±5.1545.07±5.3141.10±4.4744.09±5.1342.40±4.71模型組 24.47±2.70a 27.13±3.13a 32.20±3.95a 34.38±3.89a 36.22±3.97a艾灸組 22.40±2.2944.21±5.20b 61.19±7.68b 67.33±7.91b 74.56±9.36b

表33 組大鼠不同時間點壓力性損傷創面組織中P-ERK1/2 表達水平比較（x±s，n=6）Table 3 Comparisons of expression levels of P-ERK1/2 protein on the wound surface in 3 groups of rats with pressure injuries at different timepoints

圖23 組大鼠不同時間點壓力性損傷創面組織中RAS 表達情況（×400）Figure 2 Expression of RAS protein on the wound surface in 3 groups of rats with pressure injuries at different time-points

圖33 組大鼠不同時間點壓力性損傷創面組織中P-ERK1/2 表達情況（×400）Figure 3 Expression of P-ERK1/2 protein on the wound surface in 3 groups of rats with pressure injuries at different time-points

3 討論

《瘍科心得集·瘍證總論》［8］曾載：“夫病之來也……而其致病之由，又不越乎內因、外因二者?！眽毫π該p傷通常繼發于創傷截癱、痿證、中風偏癱等重大慢性疾病后，此類疾病的共性特點為因疾病限制活動，故喪失生活自理的能力并長期臥床。艾灸能夠調暢氣機，營衛自和，可消除久病所致的瘀血等病理產物。艾灸燃燒時利用其溫熱效應，可針對腧穴及所在經絡發揮溫經散寒及調節氣血的作用，同時將艾絨的本身藥效作用于其中，共奏行氣活血，通經活絡之功效［9］。另外，艾灸可以激發人體的正氣，正氣充實則足以抵御外來的邪氣。研究表明，艾灸不僅能夠明顯抑制大腸埃希菌、綠膿桿菌及金黃色葡萄球菌，在改善血供方面兼具優勢，其能夠迅速加快肉芽組織的生長，炎癥及其他滲出物亦由此得到有效的消散及吸收，繼而使創面的愈合進程得到顯著的加快，明顯縮短創面修復所需時間［10-11］。

ERK 存在于諸多細胞中，具有穩定性較強的特點。楊忠華［12］認為電針也許通過激活RAS/RAF/MEK/ERK 信號通路發生級聯反應后，發揮促進細胞增殖及分化的作用，由此保護了由于腦缺血致使的神經血管損傷。研究表明，VEGF 在損傷出現以后立即增高，3 d 達高峰，隨后逐漸降低，對于這一現象考慮為自損傷出現至3 d 階段，機體通過基因調控方式加快血管新生，3 d 后，由于其自身修復能力迅速下降故導致VEGF 低表達［13］。邵妍等［14］通過構建腦缺血-再灌注模型后，觀察眼針運動療法對腦缺血半暗帶區VEGF 的影響，分別以基因和蛋白水平測定作為檢測手段，發現正常組織中的VEGF表達不活躍，損傷出現后無論基因水平還是蛋白水平均呈過表達狀態，繼而加速側支循環的建立，充分發揮腦保護的功能。另有研究曾報道，VEGF 及其受體的表達含量與局部缺血及缺氧的環境存在密切關系，后者會一定程度促進前者的表達，繼而加速新生血管的形成［15］。根據上述研究結果可以推斷，VEGF、VEGFR2 的表達狀況可能與RAS/RAF/MEK/ERK 信號通路的啟動及激活存在密切的關聯。

本研究結果顯示，VEGF 蛋白在正常皮膚組織中呈弱陽性表達，當壓力性損傷出現后，其在創面組織中的表達呈先高后低趨勢，其陽性表達部位在胞質中，表達于巨噬細胞及上皮細胞中。與空白組相比，模型組創面組織中VEGF 蛋白表達水平在各個時間點均顯著升高。第1、3、5、7、10 天模型組壓力性損傷創面組織中VEGF 表達水平高于空白組，第3、5 天艾灸組壓力性損傷創面組織中VEGF 表達水平高于模型組。與正常組織相比，當壓力性損傷出現后，其創面組織中RAS 蛋白表達先低后高的趨勢，其陽性表達部位在胞質中。與空白組相比，模型組創面組織中RAS 蛋白表達水平在各個時間點顯著下降，兩組組內（即艾灸組和模型組）RAS 蛋白均呈逐漸增高的趨勢。第1、3、5、7、10 天模型組壓力性損傷創面組織中RAS 表達水平低于空白組，第3、5、7、10 天艾灸組壓力性損傷創面組織中RAS 表達水平高于模型組。當壓力性損傷出現后，創面組織中P-ERK1/2 蛋白表達較正常皮膚組織呈先高后低趨勢，其陽性表達部位在胞質中，兩組組內（艾灸組和模型組）P-ERK1/2 蛋白表達水平均呈先高后低趨勢，但在表達峰值方面確有區別，前者峰值在治療3 d 后，而后者峰值卻在碘伏處理5 d 后。第3、5、7、10 天，模型組壓力性損傷創面組織中P-ERK1/2 表達水平高于空白組，第3、5 天艾灸組壓力性損傷創面組織中P-ERK1/2 表達水平明顯高于模型組。

以上結果表明，壓力性損傷出現后，創面組織中VEGF表達水平較正常組織呈高表達狀態，考慮其屬應激性增高狀態，原因可能為損傷出現后創面局部處于缺血缺氧環境狀態，致使VEGF 蛋白應激性升高，繼而促進血管新生，用以滿足對損傷部位的血供，但是隨著上述創面局部缺血缺氧狀態的改善，其創面自身修復的存在，肉芽組織隨之呈逐漸增多趨勢，繼而VEGF 表達呈下降趨勢。由此可以推斷，當壓力性損傷形成后，局部組織能夠形成一種自身對外界的保護（即其能夠通過促使VEGF 的分泌，使其成為高表達狀態）。如若上述保護機制能夠通過一種干預手段得到有效的延伸，換言之，尋求一種治療手段能夠促進壓力性損傷創面組織VEGF 的表達和釋放，就能夠一定程度上緩解缺血-再灌注的進展，從而加速新生血管的生成，促進創面的愈合及修復。本研究結果恰揭示，艾灸干預能夠分別從VEGF 表達水平及其表達時限兩個方面兼具優勢，即促進創面組織VEGF 表達水平的同時又提前其高峰值的表達時限，繼而從整體上加速創面修復進程，縮短壓力性損傷修復的所需時間，最終達到促進創面愈合的目的。壓力性損傷形成后，創面組織中RAS 表達水平驟降，其在經過艾灸干預后發生顯著變化而明顯增加。RAS表達水平呈現的遞增趨勢說明RAS/RAF/ERK 信號通路可能參與了組織損傷的修復，艾灸干預促進壓力性損傷創面組織VEGF 的釋放后，呈瀑布式狀態啟動RAS/RAF/ERK 信號通路，并且對于這一通路中上游蛋白酶的激活需要刺激量的不斷積累，當達到累積刺激閾值后方可激活相關的信號分子，因此艾灸干預可能通過激活RAS 蛋白啟動上述信號通路。當壓力性損傷出現后，P-ERK1/2 表達水平呈先高后低的趨勢，模型組高峰值出現于碘伏處理5 d 后，而艾灸干預后將其表達高峰提前為治療3 d 后。另外，艾灸干預在活性方面（即活化狀態）促進ERK1/2 的磷酸化表達水平。由此推斷，艾灸干預促進壓力性損傷創面VEGF 的釋放后，可能通過刺激量的累積閾值啟動RAS/RAF/ERK 信號通路中的上游蛋白酶，并能夠磷酸化通路中的下游蛋白ERK1/2，激活這一通路，將信號由細胞外轉導至細胞內，促進調控細胞的增殖與遷移。鑒于免疫組化對于目的蛋白的檢測手段在定量分析方面不夠精準，尚屬半定量分析，本課題組后續的研究中將著力于通過Western Blot法對靶蛋白進行定量分析，旨在最大程度上客觀、精準地探討艾灸促進壓力性損傷組織血管新生的分子調控機制。

綜上所述，艾灸干預從蛋白層面上調壓力性損傷創面組織中VEGF 表達水平，其可能通過激活RAS/RAF/ERK 信號通路，上調RAS 蛋白表達水平、促進ERK1/2 蛋白的磷酸化水平，增強RAS/RAF/ERK 信號通路的活性，發揮促進血管內皮細胞增殖的作用。

作者貢獻：于杰進行研究設計與實施、資料收集整理、撰寫論文并對文章負責；李洪玲進行研究實施、評估、資料收集；于杰、趙惠進行論文的修訂、英文的修訂；孫忠人進行質量控制及審校，對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。