維氏氣單胞菌的smpB、tmRNA及hfq敲除菌株減毒活疫苗篩選

徐一軻,孫愉宸,盛強龍,李宏,馬香,唐燕瓊,劉柱

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維氏氣單胞菌的及敲除菌株減毒活疫苗篩選

徐一軻,孫愉宸,盛強龍,李宏,馬香,唐燕瓊*,劉柱

海南大學熱帶農林學院, 海南 海口 570228

為篩選維氏氣單胞菌減毒活疫苗，為水產重要細菌性病害的防控提供新策略，本文通過熒光實時定量PCR檢測三種敲除型菌株、及中毒力相關基因表達；并采取腹腔注射法對尼羅羅非魚進行野生型及三種敲除型感染，觀察染病羅非魚癥狀，計算累計死亡率及LD50。結果表明，維氏氣單胞菌野生型與三種敲除型菌株相比，細菌毒力相關蛋白表達均呈現顯著差異，部分毒力相關基因顯著下調；三種敲除型菌株LD50分別增加1.24、5.32和19倍。由此可見，三種敲除型維氏氣單胞菌可作為候選減毒疫苗，下調顯著的菌株是制備減毒疫苗的首選。

維氏氣單胞菌; 基因敲除; 毒力測定; 減毒疫苗

維氏氣單胞菌（）隸屬氣單胞菌科，氣單胞菌屬，為革蘭氏陰性短桿菌[1]，其普遍存在于淡水、污水、土壤乃至海水中[2]。維氏氣單胞菌是一種重要的人、獸及水生生物共患病原菌，可引起羅非魚等多種魚類發病，導致器官衰竭乃至死亡，對水產養殖業造成巨大的損失；還可引起人腦膜炎、敗血癥等[3]。近年的研究表明，污染的家畜肉類、水產品、蔬菜等均為維氏氣單胞菌的重要傳染源，因此一些國家已經將其作為水體質量和食品安全的檢疫對象[4,5]。目前對維氏氣單胞菌尚缺乏有效的防治辦法，主要依賴抗菌藥物等，導致耐藥性病原菌的形成、藥物殘留、環境污染等諸多弊端，而疫苗則是解決此類問題的有效途徑之一。常用的疫苗種類包括減毒活疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗等，其中減毒活疫苗具有保護力強、保護時間長、成本低廉、易于生產等優點，因此選擇使用基因工程的方法構建維氏氣單胞菌減毒活疫苗。

反式翻譯系統是細菌中普遍存在的核糖體拯救機制，其核心分子為轉移-信使RNA（Transfer-messenger RNA，）和Small protein B（），前者為包含tRNA樣結構域（TLD）以及編碼8-35個氨基酸短肽的信使樣結構域（MLD）的小分子RNA[6]，后者是一種特異性親和的小RNA結合蛋白。反式翻譯系統一方面可以釋放滯留的核糖體，以保證細胞的正常生理活性，另一方面可以在未完成正常翻譯的肽段后端添加標記肽，使其被水解酶識別并降解[7]。由于反式翻譯系統對細菌的生存具有重要意義，因此選擇了及作為構建減毒活疫苗的候選基因。

(Host Factor for RNA Phage Qβ)是細菌中普遍存在的RNA伴侶蛋白[8]。是一個全局性調控因子，在細菌的轉錄后水平發揮著巨大的作用。有研究表明對細菌的生長、運動能力、基因的整體表達、生物膜的形成及毒力均有重要影響[9]。多種革蘭氏陰性致病菌，如流產布魯桿菌（）、沙門氏菌（spp）和霍亂弧菌（），其缺失突變株感染小鼠時表現毒力減弱[10-14]。

為了篩選用于制備維氏氣單胞菌減毒活疫苗的潛在菌株，以本實驗室先前制備的維氏氣單胞菌、及敲除株為研究對象，通過實時定量PCR檢測其毒力相關基因的表達變化，并通過腹腔注射尼羅羅非魚，測定其半致死濃度（LD50），評價其免疫效果。本研究的結果為進一步開發研制高效、安全的維氏氣單胞菌減毒活疫苗奠定了理論基礎，對于嚴重危害水產的細菌性病害的防治具有重要的理論和實踐意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

尼羅羅非魚魚苗及飼料購自海南寶路水產科技有限公司，維氏氣單胞菌菌株（C4）野生型、敲除型、敲除型以及敲除型由本課題組自行分離、制備并保存。

1.2 敲除型菌株驗證

解凍維氏氣單胞菌C4野生型、敲除型、敲除型以及敲除型后，直接接種于添加了氨芐青霉素的LB培養基平板中，30 ℃過夜活化。長出菌落后分別隨機挑取單菌落進行菌落PCR驗證菌株，使用的引物為本課題組自行設計的維氏氣單胞菌特異性引物以及、和的敲除型驗證引物（表1）。

表 1 各敲除型驗證引物及維氏氣單胞菌特異性引物

1.3 熒光實時定量PCR

表 2 熒光實時定量PCR檢測的基因及其引物

選取維氏氣單胞菌中18個毒力相關基因，設計相應的實時定量PCR引物（表2）。提取維菌野生型及各敲除型的總RNA，采用TaKaR公司生產的反試劑盒進行反轉錄，得到模板cDNA，利用TaKaRa公司生產的TB Green染料，通過嵌合熒光法進行檢測。使用儀器為羅氏（Roche）公司的LightCycler?96qPCR儀。使用“相對表達量=2-ΔΔCq”公式計算得到各基因的表達變化，并且使用GraphPad prism7.0進行作圖以及校驗。

1.4 尼羅羅非魚注射感染維氏氣單胞菌

采用腹腔注射方式對尼羅羅非魚（）魚苗進行維氏氣單胞菌感染。首先，將各菌種活化后以0.02 OD/mL接種于添加了氨芐青霉素的液體LB培養基中，30 ℃培養20 h達到穩定期后，收集菌體并用生理鹽水配制成濃度分別為109cfu/mL、108cfu/mL、107cfu/mL的菌懸液。然后，以體重為1 g的羅非魚魚苗為實驗對象，向每條魚體內各注射10 μL的菌懸液，并置于容積60 L的玻璃缸中養殖，水溫控制在26~28 ℃，每天投喂魚苗專用粉劑飼料2次，每隔2 d換水1次。感染后首日每隔1 h觀察一次羅非魚發病或死亡情況，之后每隔1日觀察記錄1次，并及時撈出死魚。持續觀察1周。

1.5 半致死濃度（LD50）的測定

羅非魚魚苗被感染后，觀察1周記錄累積死亡率，并且利用改良寇氏法計算維氏氣單胞菌野生型及各敲除型的半致死濃度（LD50）[15]。比較LD50以驗證各菌株毒力的變化。

2 結果與分析

2.1 野生型及敲除型菌株驗證

使用維氏氣單胞菌特異性引物以及各敲除型驗證引物驗證菌株。圖1A為維氏氣單胞菌敲除型驗證，1~6泳道為野生型，7~12泳道為敲除型，從條帶可以看出敲除型比野生型減少了約400 bp，證明敲除成功。圖1B為維氏氣單胞菌敲除型驗證，1~6泳道為野生型，7~12泳道為敲除型，結果顯示敲除型比野生型減短了約500 bp，證明敲除成功。圖1C則為對圖1A、B中24個菌株的維氏氣單胞菌特異性引物驗證結果，結果顯示24株菌均為維氏氣單胞菌。圖1D為對維氏氣單胞菌敲除型驗證，1、2泳道為野生型，3、4泳道為敲除型，可以看出敲除型較野生型減短了約500 bp，證明敲除成功，5~8泳道則為維氏氣單胞菌特異性引物驗證，證明得到1~4泳道的4株菌均為維氏氣單胞菌。

2.2 熒光實時定量PCR檢測毒力相關基因表達

實時定量PCR結果表明，與維氏氣單胞菌野生型相比較，敲除型菌株中，氣溶素（Aerolysin）與III型分泌系統相關蛋白表達極顯著地上調，而彈性蛋白酶（Elastase）表達極顯著地下調（圖2）；在敲除型菌株中僅檢測到上調的毒力及相關基因，包括氣溶素（Aerolysin）、外膜蛋白、外膜蛋白組裝因子、RNA結合蛋白、應激保護蛋白、應激蛋白（圖3）；而在敲除型菌株中同時檢測到上調和下調的毒力基因，其中，氣溶素（Aerolysin）、III型分泌系統相關蛋白及，多重耐藥性調控蛋白均極顯著上調，而脂肪酶、外膜蛋白、應激蛋白等基因的表達量明顯下調（圖4）。

圖 2 維氏氣單胞菌smpB敲除型中差異變化極顯著的基因實時定量PCR結果

*：=0.05；**：=0.01 (下同）

Fig.2 The Quantitative Real-time PCR results fromΔ

*:=0.05；**:=0.01 （The same as follows）

圖 3 維氏氣單胞菌tmRNA敲除型中差異變化顯著的基因實時定量PCR結果

圖 4 維氏氣單胞菌hfq敲除型中差異變化顯著的基因實時定量PCR結果

2.3 菌株半數致死量（LD50）測定

圖 5 各菌株腹腔注射羅非魚后的累計死亡率

經過改良寇氏法計算得到，維氏氣單胞菌野生型的半致死濃度為1.41×107cfu/mL（圖5A）；維氏氣單胞菌敲除型的半致死濃度為3.16×107cfu/mL（圖5B），與野生型相比毒力下降了2.24倍；維氏氣單胞菌敲除型的半致死濃度為8.91×108cfu/mL（圖5C），與野生型相比毒力下降了6.32倍；維氏氣單胞菌敲除型菌株的半致死濃度為2.82×108cfu/mL（圖5D），與野生型相比毒力下降了20倍。

3 討論

目前，國內最近幾年由維氏氣單胞菌感染引起水產養殖病害的報道逐年增多，對水產養殖業造成巨大經濟損失；同時在公共健康領域關于維氏氣單胞菌的報道也逐年增多，尤其以腹瀉和肺炎等病例為甚。根據中國知網數據庫（CNKI）的數據，2001年至2015年間國內分離并報道的維氏氣單胞菌病例呈現逐年上升趨勢，如2011年廣東省某鯰魚養殖場爆發的潰瘍綜合征、2014年8月四川雅安某水庫加州鱸魚的大面積死亡等，經過分離鑒定其優勢菌株均為維氏氣單胞菌[16]。因此無論是從水產養殖業發展，還是公共衛生安全角度出發，維氏氣單胞菌的防治都應該被重視。本實驗探索通過基因敲除技術構建維氏氣單胞菌的減毒株，并且取得了一定的成效，為以后維氏氣單胞菌疫苗的研發提供了理論依據和研究基礎。

減毒活疫苗可以引發機體免疫反應，刺激特異性的記憶B細胞和T細胞的產生，使機體獲得長期或終生保護作用。與滅活疫苗相比，減毒活疫苗具有免疫力強、作用時間長的優點。減毒活疫苗發展初期主要由物理和化學方法制備而成[17]。而隨著近年來分子生物學技術的發展，基因工程已經成為更加精準和便捷的減毒活疫苗制備方法。本實驗旨在通過敲除反式翻譯拯救系統的核心元件和，以及起到廣泛調控作用的RNA結合蛋白，篩選可用于研發有效減毒疫苗的潛在菌株。一方面通過實時定量qPCR驗證相應基因敲除后，包括氣溶素（Aerolysin）、耐熱溶血素（Thermostable hemolysin）、脂肪酶（Lipase）、彈性蛋白酶（Elastase，），以及外膜蛋白、應激蛋白、III型分泌系統相關蛋白、多重耐藥性調控蛋白等毒力相關基因的表達情況；另一方面通過注射感染羅非魚，測定LD50的變化情況。本研究結果表明，氣溶素（Aerolysin）的表達在各敲除型菌種均明顯上調，但是注射結果卻均顯示LD50呈現不同程度的下降。在維氏氣單胞菌敲除型中，僅檢測到3個毒力基因的表達發生了顯著性變化，相應地其毒力也僅下降2.24倍；而敲除型中，具有顯著差異的基因表達量均為上調，但是注射羅非魚后的LD50卻下降6.32倍，這些結果表明反式翻譯系統核心元件和可能對于維氏氣單胞菌的毒力影響不大。敲除型中，較多毒力相關基因的表達量均發生變化，并且LD50下降了20倍，表明可以對維氏氣單胞菌的毒力產生顯著影響。本研究所檢測毒力相關基因表達量變化趨勢與相應菌株LD50的變化趨勢看上去不一致，這可能是由于本研究檢測的毒力相關基因有限所導致的。這樣的結果暗示，細菌的毒力受到十分復雜的因素影響，可能包括我們所檢測的毒力相關基因以外的其他更復雜的生物途徑，僅通過檢測有限基因的表達量變化可能并不能真實反映細菌毒力水平。基于本研究的結果，敲除型表現減毒效果最佳，證明了其具有進一步研發作為減毒活疫苗的潛力。

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Screening out Live Attenuated Vaccine fromStrain withoutor

XU Yi-ke, SUN Yu-chen, SHENG Qiang-long, LI Hong, MA Xiang, TANG Yan-qiong*, LIU Zhu

570228,

In order to screen out live attenuated vaccines fromso as to provide a new strategy for controlling against bacterial diseases of aquatic products, toxic gene expressions ofstrainsdeletedorwere detected by Quantitative Real-time PCR. The symptom, accumulative death rate and LD50 of the wildandsome infected with deleted strains by Intraperitoneal injection were recorded or calculated. The resulted showed there were significant differences among bacterial toxicity relative protein expressions of three deleted strains and wildsome of them obviously went down, LD50 of three strains added up to 1.24, 5.32 and 19 times, respectively. Therefore the deletedstrains could be developed for candidates of attenuated vaccines,strain was a first choice.

; gene deletion; toxicity detection; attenuated vaccine

S943

A

1000-2324(2019)02-0186-05

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.02.002

2018-05-12

2018-08-20

國家自然科學基金項目(31560021;31772887;31860676);海南省自然科學基金(317015);海南省重點研發計劃(ZDYF2017020)

徐一軻(1992-),男,碩士研究生,研究方向:農業生物技術. E-mail:xuyike1992@foxmail.com

Author for correspondence. E-mail:tyq68@126.com