遼寧地區豬常見傳染病流行病學調查及遺傳進化分析

關淼,顧貴波,楊本勇,趙培,閆明,劉耀川,魏萍

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遼寧地區豬常見傳染病流行病學調查及遺傳進化分析

關淼1,2,顧貴波2,楊本勇2,趙培2,閆明2,劉耀川2,魏萍1*

1. 東北農業大學 動物醫學學院, 黑龍江 哈爾濱 150000 2. 遼寧省動物疫病預防控制中心 遼寧省動物醫學研究院, 遼寧 沈陽 110164

為研究豬瘟(Classical Swine Fever,CSF)、豬偽狂犬(Porcine pseudorabies，PR)、豬圓環病毒病(Porcine circovirus virus disease，PCVD)、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(Highly pathogenic-Porcine reproductive and respiratory syndrome，HP-PRRS)在遼寧省內的發病情況及致病毒株變異情況，本研究對遼寧地區自2012年至2016年五年內4種豬常見流行病進行流行病學調查，并對擴增陽性樣品的主要致病基因進行遺傳進化分析。在 9600份樣品中，CSFV (Classical Swine Fever virus)陽性18例、PRV陽性12例、PCV2陽性10例、HP-PRRSV陽性5例。選取CSFV代表毒株命名為LN01, LN02, LN03；PRV代表毒株LN04, LN05；PCV代表毒株LN06, LN07；HP-PRRSV代表毒株LN08，分別對其進行遺傳進化分析。結果表明，CSFV代表株中，LN01與LN02的同源性較高，二者與GD株親緣關系最近，同源性為99%以上；LN03株與HD株同源性較高為99.5%；PRV代表株中LN04與PV株的親緣關系最近，同源率為99.4%；LN05與PD株親緣關系最近，同源率為98.5%；PCV2代表株中LN06與GD株的親緣關系最近，同源率為99.5%，與HQ 395021親緣關系最遠，同源率為88.4%，LN07與BF株的親緣關系最近，同源率99.1%；HP-PRRSV代表毒株LN08與參考株GD-SS株的親緣關系最近，同源率為99.8%。

CSF; PR; PCVD; HP-PRRS; 流行病學調查; 遺傳進化分析

豬瘟(Classical Swine Fever, CSF)、高致病性藍耳病(Highly pathogenic-Porcine reproductive and respiratory syndrome, HP-PRRS)、豬偽狂犬病(Porcine pseudorabies, PR)、豬圓環病毒病(Porcine circovirus virus disease, PCVD)是規模化養豬場的常發疫病。CSF是由豬瘟病毒(Classical Swine Fever virus, CSFV)引起的豬高度接觸性、出血性傳染病，臨床癥狀及病理變化較為復雜，易與其他豬病混淆[1-3]；PR是由偽狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus, PRV)引起的一種以豬繁殖障礙及呼吸癥狀為主要臨床表現的急性、接觸性傳染病[4,5]；PRRS是一種能夠導致豬群持續高熱及繁殖功能障礙的高致死率接觸性傳染病[6,7]；PCVD是由圓環病毒(Porcine circovirus virus, PCV)引起，能夠導致豬多系統衰竭、母畜繁殖障礙、仔豬先天性震顫等癥狀的疫病。PCV通常分為PCV1型和PCV2型，臨床上PCV1型并無致病性，PCV2型具有較強的致病性[8,9]。遼寧省生豬養殖規模較大，對豬常見傳染性疾病進行長期跟蹤調查，對促進畜牧業發展、保障食品安全等均有較現實意義。本試驗對遼寧省上述4種豬常見傳染病2012~2016年的流行病學調查、分析，以期為遼寧地區豬病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理

2012年至2016年的5年期間，按每年4個季度，共計20個時間節點，在遼寧省16個市、縣隨機選擇一個屠宰場，每場采集外觀健康豬的組織樣品(脾臟、淋巴結、腎臟等)30頭份，共計9600頭份組織樣品。取適量組織樣品混勻后進行勻漿處理，用于PCR鑒定。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑Trizol、反轉錄試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；SYBR PremixTaq、DNA marker購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)；RNA酶抑制劑購自Axygen公司；凝膠回收純化試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。其余試劑由遼寧省動物疫病預防控制中心提供。

1.3 引物設計

根據GenBank中登陸的CSFV(KP702208)、PRV(AF080571)、PCV2(AY181945)和HP-PRRSV(EU556183)在NCBI中基因序列及相關參考文獻報道，CSFV根據胡建和[10]等建立的豬瘟強弱毒鑒別多重PCR方法設計引物。利用Primer 5.0引物設計軟件，選擇上述病毒基因保守區設計檢測引物及主要致病基因的全序列擴增引物。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成（表1、2）。

表1 CSFV、PRV、PCV2、HP-PRRSV檢測引物

表2 CSFV、PRV、HP-PRRSV主要致病基因及PCV2全基因組測序引物

1.4 收集樣品的PCR檢測

將2.0 g組織樣品按1:5比例用生理鹽水研磨成組織勻漿，反復凍融3次，8000 r/min離心5 min取上清液，按照RNA提取試劑盒說明書要求提取樣品總RNA。經反轉錄制備cDNA后，使用檢測引物進行PCR擴增，檢測CSFV、PRV、PCV及HP-PRRSV。反轉錄參數：42 ℃孵育15 min；85 ℃加熱反應完畢。PCR反應程序：94 ℃4 min；94 ℃1 min、(CSFV 55.3 ℃、PRV 56.3 ℃、PCV 52.9 ℃、HP-PRRSV 54.6 ℃)1 min、72 ℃1 min，共30個循環；72 ℃7 min。產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，并將陽性片段送至生工生物工程(上海)有限公司進行序列測定。

1.5 病毒主要致病基因的擴增

根據1.4病毒檢測結果，以檢測陽性樣品cDNA為模板，使用病毒主要致病基因測序引物，擴增CSFV、PRV、HP-PRRSV的主要致病基因及PCV2全基因組。反應程序：94 ℃4 min；94 ℃1 min、(CSFV57.3 ℃、PRV56.2 ℃、PCV55.3 ℃、HP-PRRSV54.7 ℃)1 min、72 ℃1.5 min，30個循環；72 ℃ 7 min。產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，克隆后由生工生物工程(上海)有限公司進行序列測定，并使用MegAlign軟件對測得序列與GenBank中國內外相應病毒株序列進行遺傳演化分析。

2 結果

2.1 病毒PCR檢測結果

對2012~2016年遼寧地區的屠宰場樣品進行CSFV、PRV、PCV2、HP-PRRSV PCR檢測，共計檢測樣品9600份，陽性樣品共計45份，其中CSFV 18例(0.19%)、PRV 12例(0.12%)、PCV2 10例(0.10%)、HP-PRRSV 5例(0.05%)，未發現從同一樣品中檢出2種或以上病毒情況(表3)，部分PCR檢測結果見圖1。

表3 2012~2016年遼寧地區CSFV、PRV、PCV2、HP-PRRSV陽性結果

圖 1 部分病毒PCR檢測結果

M: DL-2000 DNA Marker; 1: CSFV陽性對照；5：PRV陽性對照；9：PCV陽性對照；13：HP-PRRSV陽性對照；2,6,10,14：陰性對照；其他為陽性結果。

M:DL-2000 DNA Marker; 1: CSFV positive control; 5: PRV positive control; 9: PCV positive control; 13: HP-PRRSV positive control; 2,6,10,14: negative control; others presented the positive results.

2.2 病毒主要致病基因擴增結果

根據病毒篩查結果，在陽性樣品中對相應病毒的主要致病基因進行擴增。結果表明，在病毒陽性的樣品中均能夠檢出相應病毒的主要致病基因。部分檢測電泳結果見圖2。

圖 2 部分主要致病基因及PCV 2型PCR檢測結果

M：DL-2000 DNA Marker；1：E2基因陽性對照；4：TK基因陽性對照；7：PCV 2型陽性對照；10：HP-PRRSV ORF5基因陽性對照；2,5,8,11：陰性對照；其他為陽性結果。

M: DL-2000 DNA Marker; 1: E2 gene positive control; 4: TK gene positive control; 7: PCV2 positive control; 10: HP-PRRSV ORF5 gene positive control; 2,5,8,11: negative control; others presented the partial positive results.

2.3 CSFV囊膜糖蛋白(E2)核苷酸序列遺傳進化分析結果

利用Mega5.05軟件將分離毒株的基因與GenBank中已公布的國內外參考序列進行核苷酸序列及氨基酸序列比對，并構建系統進化樹。2013年檢測到的3份CSFV陽性樣品的基因序列與其代表株GDHZ(HQ697223)同源性為92.5%~98.9%，2014年檢測到的9份CSFV陽性樣品的基因與其代表株GDHZ(HQ697227)同源性為86.3%~94.1%，較2013年比基因同源性降低，表明毒株基因已經發生突變。2016年檢測到6個CSFV陽性樣品與其代表株YC11(KC149990)同源性為93.5%~99.5%。將每年選取一個陽性代表毒株，命名為LN01、LN02、LN03。結果表明，LN01與LN02的同源性較高，二者與廣東GD株(HQ697223)親緣關系最近，同源性為99%以上，與越南YN株(KP702210)親緣關系較遠，同源性為92.8%和93.6%。LN03株與韓國HD株(KC149990)同源性較高為99.5%。與山東SD株(KT953611)親緣關系較遠為92.6%。LN01與GDHZ(HQ697223)株相比，共有45個堿基替換，在543~548位置存在一個CGGATG的插入。氨基酸共有42處替換，aa181處有兩個氨基酸插入。LN02與GDHZ(HQ697223)相比共有共有104個堿基替換，沒有新的插入序列。氨基酸共有96處替換。LN03與GDHZ(HQ697223)的親緣關系較遠，與KC株親緣關系較近，僅有14個堿基替換。E2基因遺傳進化分析具體結果見圖3。

圖 3 CSFV E2基因進化樹

圖注：(KT 953611, 2015華東地區; KU375263, 2016 黑龍江; DQ907715, 2006 北京; KC149990, 2013 韓國; KT853105, 2015 吉林; AY554397, 2005 臺灣 ; GQ902941, 2010 丹麥; HQ697223, 2010 廣東; JX262391, 2012 湖南; KP702210, 2014韓國)

Note: (KT 953611, 2015 East China; KU375263, 2016 Heilongjiang, DQ907715, 2006 Beijing, KC149990, 2013 Korea, KT853105, 2015 Jilin, AY554397, 2005 Taiwan, GQ902941, 2010 Denmark, HQ697223, 2010 Guangdong, JX262391, 2012 Hunan, KP702210, 2014 Korea)

2.4 PRV的胸腺激酶(TK)核苷酸序列遺傳分析結果

利用Mega5.05軟件將分離毒株的基因與GenBank中已公布的國內外參考序列進行核苷酸序列及氨基酸序列比對，并構建系統進化樹。2013年檢測到的5份PRV陽性樣品基因與其代表株PV(AY217095)的同源性為93.2%~99.4%，2015年檢測到的7份PRV陽性樣品的基因序列與其代表株PD(AF080571)的同源性為91.7%~99.5%。2013年與2015年的毒株之間的同源性并不高，為不同毒株感染所致。選取兩個代表毒株命名為LN04和LN05，LN04與參考株HB株(AY217095)的親緣關系最近，同源率為99.4%，與PD株(AF080571)親緣關系最遠，同源率為81.5%。LN05與PD株(AF080571)親緣關系最近，同源率為98.5%，與PV株(AY217095)親緣關系最遠，同源率為81.3%。LN04與PV株(AY217095)相比，共有13個堿基替換。氨基酸共有11處替換。LN05與PD株(AF080571)相比，存在21處堿基替換，并在156~163處存在CATTGCAT序列插入。氨基酸共有20處替換，1處插入。TK基因遺傳進化分析具體結果見圖4。

圖4 PRV TK基因進化樹

圖注：(AF080571, 1998 武漢; AY171242, 2003 鄭州; KU315430, 2015 武漢; KX423960, 2016 湖北; KU056477, 2015 山東; HQ229001, 2011 四川; JF797217, 2011 美國; KF381394, 2013 河南; AY217095, 2003 韓國)

Notes: (AF080571, 1998 Wuhan, AY171242, 2003 Zhengzhou, KU315430, 2015 Wuhan, KX423960, 2016 Hubei, KU056477, 2015 Shandong, HQ229001, 2011 Sichuan, JF797217, 2011 us, KF381394, 2013 Henan, AY217095, 2003 Korea)

2.5 PCV2核苷酸序列遺傳分析結果

利用Mega5.05軟件將分離毒株的基因與GenBank中已公布的國內外參考序列進行核苷酸序列及氨基酸序列比對，并構建系統進化樹。2012年檢測到1份PCV2陽性樣品的基因序列與其代表株HX(KC860786)同源率99.0%。2014年檢測到5份PCV2陽性樣品的基因序列與代表株PC(AY177626)的同源率為93.6%~99.5%。2015年檢測到的4份PCV2陽性樣品基因序列與其代表株BF(AF381175)的同源率為91.1%~99.1%。將2014年與2015年每年選取一個代表株命名為LN06和LN07，LN06分離株與廣東分離GD株(AY177626)的親緣關系最近，同源率為99.5%，與TJ株(HQ395021)親緣關系最遠，同源率為88.4%。LN07分離株與分離株BF(AF381175)的親緣關系最近，同源率99.1%。與TJ株(HQ395021)親緣關系較遠，進化樹中不在同一分支，同源率為81.3%。LN06與HX株(KC860786)相比共有45處核苷酸替換以及35處氨基酸替換。LN07與PC株(AY177626)相比共有35處核苷酸替換，29處氨基酸替換。PCV 2型遺傳進化分析具體結果見圖5。

圖5 PCV 2型基因進化樹

圖注：(AF381175, 2005 北京; EF524540, 2009 北京; AB072303, 2009 日本; AY094619, 2003 美國; AY322004, 2004 法國; HQ202948, 2012 臺灣; AY146991, 2002 臺灣; AY177626, 2003 廣東; KT819162, 2015 巴西; HQ395046, 2012 北京; HQ395032, 2010 河北)

Note: (AF381175, EF524540, Beijing 2005; Beijing 2009; AB072303, 2009 AY094619, 2003 United States Japan; AY322004, 2004; HQ202948, France; Taiwan 2012; Taiwan 2002; AY146991, AY177626, KT819162, Guangdong 2003; Brazil 2015; Beijing 2012; HQ395046, HQ395032, Hebei 2010)

2.6 HP-PRRSV ORF5核苷酸序列遺傳分析結果

利用Mega5.05軟件將分離毒株的基因與GenBank中已公布的國內外參考序列進行核苷酸序列及氨基酸序列比對，并構建系統進化樹。2013年檢測到的1份HP-PRRSV陽性樣品的核苷酸序列與其代表株US(EU 556203)同源性為99.6%。2014年4份HP-PRRSV陽性樣品的核苷酸序列與其代表株GD-SS(KX228532)的同源性為94.5%~99.8%。選取2014年陽性樣品代表株命名為LN08，LN08株與參考株GD-SS (KX228532)的親緣關系最近，同源率為99.8%，與HD株(JX215553)親緣關系較遠，同源率為83.3%。LN08與GD-SS株(KX228532)相比存在19處不連續的核苷酸缺失及替換，于255~260位發生AGTCCT序列插入。氨基酸共有19處替換，并在aa179處存在兩個氨基酸的插入。LN08經比對結果屬于PRRSV譜系8.7，具有較強的致病力。HP-PRRSV ORF5基因遺傳進化分析具體結果見圖6。

圖 6 HP-PRRSV ORF5基因進化樹

圖注：(JX215553, 2012華東; KM013933, 2014廣西; KJ854743, 2014云南; KC282623, 2012 廣州; KF699845, 2012 越南; AB856284, 2013 越南; KF698663, 2013 泰國曼谷; JX192639, 2013 華東; KX228532, 013 廣東)

Notes: (JX215553, 2012 East China, KM013933, 2014 Guangxi, KJ854743, 2014 Yunnan, KC282623, 2012 Guangzhou, KF699845, 2012 Vietnam, AB856284, 2013 Vietnam, KF698663, 2013 Thailand Bangkok, JX192639, 2013 East China, KX228532, 013 Guangdong)

3 討論

CSF、PR、PCVD及HP-PRRS為4種豬常見高致病性傳染病，對生豬養殖業造成重大經濟損失。隨著生豬集約化養殖的不斷發展，加之動物及其產品流通范圍增大，以及強致病性毒株及病毒突變株不斷出現，給豬病的綜合防控帶來新的挑戰[11-14]。因此對遼寧地區近5年上述4種豬常見傳染病流行病學調查及病原核苷酸序列的遺傳進化分析，對疾病的流行、傳播趨勢，其疾病的防控具有積極的作用。

本次試驗中2014年分離CSFV陽性毒株與2013年分離的陽性毒株同源性較高，從進化樹中可以看出是屬于同一分支，但是LN01與參考株GDHZ相比有45個堿基替換，1個CGGATG堿基插入[15]。LN02與GDHZ相比有104個堿基替換，無堿基插入，推測插入后的毒株致病性可能降低，使之不再流行。但是連續兩年都檢測出CSFV，并分離株處于同一進化分支中，推測2013年的毒株并沒有完全消滅，并于2014年繼續擴大流行，突變后的毒株具有更強的致病力[16,17]。LN03與KC株相比有14個堿基替換，推測病毒在流行過程中在不同地區及不同環境中發生變異。PRV陽性代表株LN04與LN05與其對應的參考株PV與PD相比各有13處與21處堿基突變，LN05同時伴有一段基因序列的插入。氨基酸分別有11處及20處替換，1處插入。2013年檢測出PRV后，通過防控2014年并未檢測出陽性樣品，證明防控很成功，但是2015年PRV序列中突變數并未明顯改變，但多了一段核苷酸序列插入，推測這段插入可能改變了病毒的構象，使其再次流行。PCV陽性代表株LN06與代表株HX相比有45處核苷酸替換以及35處氨基酸替換。LN07與PC株相比共存在35處核苷酸替換，29處氨基酸替換。結果顯示PCV的突變中存在較多的同義突變，并且PCV連續流行兩年的時間，推測這些突變盡管沒有改變編碼的氨基酸，但可能發生在部分重疊基因上，使其他致病基因的活性增強，或者突變影響了基因內順式調控元件的活性，使基因的轉錄表達增強等方式使PCV的致病力增強。HP-PRRSV的陽性代表株LN08與其參考株GD-SS相比共有19處替換，并在aa179處存在兩個氨基酸的插入。HP-PPRSV根據不同的基因型對不同的毒株進行譜系分析，本次分離出的LN08代表株屬于譜系8.7，是一類致病性較強的毒株[18-20]，李真等人于華北地區也分離出同譜系的毒株[21]，推測可能是兩地具有關于豬及相關產品的貿易，使病毒在兩地區流行。

CSF、PR、PC及HP-PRRS是生豬養殖過程中防控力度較大的4種疾病。在此次遼寧地區5年共9600份樣品中，共檢出上述4種疾病病原45例，整體陽性率雖僅為0.47%，但序列測定及遺傳進化分析發現，病原出現不同程度的變異且發現部分強致病性毒株。同時遺傳進化分析發現，遼寧地區發現的部分病原與其他地區報道的病原親緣關系較近，表明上述4種疾病存在較大的傳入風險。建議遼寧地區加大對上述疾病的流行病學調查力度，并持續開展病原遺傳進化檢測，為疾病的綜合防控及病原流行趨勢提供理論基礎。

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Epidemiological Investigation and Genetic Evolution Analysis of Common Pig Infectious Diseases in Liaoning Province

GUAN Miao1,2, GU Gui-bo2, YANG Ben-yong2, ZHAO Pei2, YAN Ming2, LIU Yao-chuan2, WEI Ping1*

1.150030,2.110164,

In order to study the incidence and pathogenic strains of Classical Swine Fever (CSF), Porcine pseudorabies (PR), Porcine circovirus virus disease (PCVD), Highly pathogenic-Porcine reproductive and respiratory syndrome，HP-PRRS in Liaoning province, epidemiological investigation was conducted on four common epidemic diseases of pigs in liaoning province from 2012 to 2016, and genetic evolution analysis of the main pathogenic genes in amplified positive samples was carried out. Among the 9600 tested samples, 18 cases were CSFV positive, 12 PRV positive, 10 PCV2 positive and 5HP-PRRSV positive. The representative CSFV strain named LN01, LN02, LN03;PRV representative strain LN04, LN05;PCV representative strain LN06, LN07;HP-PRRSV representative strain LN08, were selected to analyze the genetic evolution respectively. The results showed that among CSFV representative strains, the homology between LN01 and LN02 was high,the two strains were most closely related to GD strains, the homology was more than 99%;the homology of LN03 and HD strains was 99.5%; in PRV representative strains, LN04 presented the closest 99.4% homology with PV strain; LN05 presented 98.5% homology with PD strain. In PCV2 representative strains, LN06 presented closely genetic relationship with GD strain, the homology was 99.5%, and presented furthest genetic relationship with HQ395021, with the 88.4% homology. LN07 presented 99.1% homology with BF strain. HP-PRRSV represented the closest genetic relationship between LN08 and GD-SS, with the homology rate of 99.8%.

CSF; PR; PCVD; HP-PRRS; epidemiology investigation; genetic evolution analysis

S858.28;S855

A

1000-2324(2019)02-0308-07

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.02.029

2017-10-23

2018-01-10

遼寧省自然科學基金指導計劃(20170540477);遼寧省農業攻關項目(2015202013)

關淼(1982-),男,獸醫師,碩士,主要從事動物疫病研究與防控工作. E-mail:yuerjianggm@163.com

Author for correspondence. E-mail:weiiping@yahoo.com.cn