免疫球蛋白G4相關硬化性膽管炎中黏膜相關恒定T細胞的免疫生物學特性

免疫球蛋白G4相關硬化性膽管炎(IgG4-SC)是一種發病機制不明、由異常免疫介導的慢性纖維化自身免疫性疾病，其特征包括：以輔助性T細胞2(Th2)免疫主導，持續活化的成熟B淋巴細胞以及分泌高水平的血清免疫球蛋白G4(IgG4)[1]。IgG4-SC好發于60歲以上老年男性，目前其診斷尚無金標準，需結合臨床表現和實驗室、影像學及病理學檢查結果進行確診[2]。黏膜相關恒定T細胞(MAIT)是一類固有免疫T細胞[3]。近年來的研究結果顯示，MAIT細胞在自身免疫性疾病及非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)中均起到了重要作用[4-6]。目前MAIT細胞在IgG4-SC中的作用尚不明確，本研究旨在揭示IgG4-SC患者的MAIT細胞表型變化及其與臨床指標的相關性，并探討MAIT細胞在IgG4-SC發生、發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 主要試劑

淋巴細胞分離液(Ficoll-pague)購自美國GE Healthcare公司，二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，CD3、CD4、CD8、CD161、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、顆粒酶B(GrB)和白細胞介素-17(IL-17)等流式抗體購自美國BD Biosciences公司，CD8、Vα7.2和CXCR6等流式抗體購自美國BioLegend公司，細胞固定破膜劑購自美國BD Biosciences公司。

1.2 研究對象

收集自2016年3月至2018年5月在仁濟醫院消化科就診的18例IgG4-SC患者的外周血標本。采用2011年日本學者通過研討會制定的診斷標準[7]：(1)影像學等檢查顯示單個或多個器官局灶性或彌漫性腫大或包塊表現；(2)血清學檢查顯示IgG4水平高于正常值上限(≥135 mg/dL)；(3)肝臟活組織病理檢查顯示大量淋巴細胞和漿細胞浸潤伴顯著纖維化，IgG4陽性漿細胞浸潤(判斷標準為IgG4陽性細胞占IgG陽性細胞比例>40%或每個高倍鏡視野下>10個IgG4陽性漿細胞)。根據上述3項檢查結果，符合(1)+(2)+(3)要求的為確診，符合(1)+(3)要求的為擬診，符合(1)+(2)要求的為疑診。本研究納入的患者均為確診的IgG4-SC患者，且排除其他急、慢性肝病史。18名健康對照者(HC)的外周血標本于2017年1月至2018年1月采集于上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院體檢中心檢驗科，所有入選標本均保證血常規、血液生物化學、輸血全套以及甲狀腺功能檢測結果無明顯異常，且排除其他急、慢性肝病史。本研究所有入選者均知情同意，本研究方案獲得醫院倫理委員會的審批。

1.3 收集資料

收集IgG4-SC組和HC組的一般資料和實驗室檢查資料。一般資料包括年齡、性別等。實驗室檢查包括：(1)血常規指標 包括白細胞計數(WBC)、血紅蛋白(Hb)、血小板計數(PLT)等；(2)生物化學指標 包括丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、γ-谷氨酰轉移酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBil)、直接膽紅素(DBil)等；(3)免疫學指標 包括IgG4、IgG等。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0及GraphPad Prism 6.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，兩樣本均數比較采用非配對t檢驗分析，相關性采用Spearman′s rank correlation分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組的一般情況及實驗室指標比較

本研究最終納入18例IgG4-SC患者和18名健康對照者。兩組中男性均為12例，女性均為6例。IgG4-SC組年齡為30～78歲，HC組年齡為36～67歲。兩組在性別和年齡方面的差異均無統計學意義。實驗室指標檢測結果顯示，與HC組相比較，IgG4-SC組的肝損傷較明顯，IgG4-SC組的ALT和AST高于HC組。此外，IgG4-SC組的膽汁淤積也更明顯。詳見表1。

表1 兩組的一般情況及臨床資料比較

注：—為數據缺失；與HC組對比，aP<0.05，bP<0.01，cP<0.000 1

2.2 兩組的外周血MAIT細胞頻率比較

在本研究中，外周血MAIT細胞被定義為CD3+Vα7.2+CD161high淋巴細胞[8]。通過流式細胞術比較IgG4-SC組與HC組外周血中的MAIT細胞頻率，發現前者較后者顯著下降[(1.03±0.17)%比(3.72±0.68)%，P<0.001，圖1A]。進一步分析IgG4-SC組與HC組外周血中MAIT細胞亞群的頻率變化，發現兩組外周血CD4+MAIT占總T細胞的比例差異無統計學意義[(0.10±0.02)%比(0.11±0.01)%，P=0.605 4，圖1B]，而前者的CD8+MAIT和CD4-CD8-MAIT(DN MAIT)占總T細胞的比例均較后者降低[(2.37±0.43%)比(11.62±2.70)%，P<0.01；(2.98±0.91)%比(8.80±1.88)%，P<0.01，圖1C～1D]。進一步分析IgG4-SC組與HC組外周血中3種MAIT細胞占總MAIT的比例，發現前者的CD4+MAIT占MAIT細胞的比例較后者升高[(8.65±2.83)%比(2.67±0.96)%，P=0.049 6，圖1E]，而兩組的CD8+MAIT和DN MAIT占MAIT細胞的比例差異均無統計學意義[(81.89±3.08)%比(84.58±1.97)%，P=0.451 5；(11.25±2.34)%比(10.74±1.16)%，P=0.842 2，圖1F～1G]。

注：兩組相比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns為差異無統計學意義

圖1兩組的外周血中MAIT細胞及各亞組MAIT細胞頻率比較AT細胞中MAIT細胞頻率BCD4+MAIT細胞在T細胞中的占比CCD8+MAIT細胞在T細胞中的占比DDN MAIT細胞在T細胞中的占比ECD4+MAIT細胞在MAIT細胞中的占比FCD8+MAIT細胞在MAIT細胞中的占比GDN MAIT細胞在MAIT細胞中的占比

2.3 外周血MAIT細胞頻率與實驗室指標的關系

為進一步了解IgG4-SC患者外周血中MAIT細胞頻率的臨床意義，本研究將外周血中MAIT細胞的比例與實驗室指標進行相關性分析。在血常規指標方面，IgG4-SC患者較高的MAIT細胞頻率與較多的PLT數量有關(r=0.58，P<0.05，圖2A)。在免疫學指標方面，MAIT細胞頻率與IgG4、IgG均無相關性(r=-0.06，P=0.802 1；r=-0.29，P=0.275 6；圖2B、2C)。在肝功能指標方面，IgG4-SC患者的MAIT細胞頻率與TBil、DBil均無相關性(r=-0.42，P=0.135 2；r=-0.131 4，P=0.202 8；圖2D、2E)。雖然IgG4-SC患者的MAIT細胞頻率與ALP無相關性(r=-0.45，P=0.110 4，圖2F)，但其與GGT呈負相關(r=-0.81，P<0.001，圖2G)。IgG4-SC患者的MAIT細胞頻率與反映肝損傷的ALT、AST呈負相關(r=-0.60，P<0.05；r=-0.58，P<0.05；圖2H、2I)，提示外周血MAIT細胞頻率在一定程度上可反映IgG4-SC患者的疾病嚴重程度。

圖2IgG4-SC患者外周血中MAIT細胞頻率與實驗室指標的相關性分析AMAIT細胞頻率與PLTBMAIT細胞頻率與IgG4CMAIT細胞頻率與IgGDMAIT細胞頻率與TBilEMAIT細胞頻率與DBilFMAIT細胞頻率與ALPGMAIT細胞頻率與GGTHMAIT細胞頻率與ALTIMAIT細胞頻率與AST

2.4 外周血MAIT細胞分泌細胞因子變化

本研究對比分析了兩組外周血中MAIT細胞分泌細胞因子的功能，發現相較于HC組，IgG4-SC組分泌GrB、IFN-γ和TNF-α的MAIT細胞比例均升高[(13.78±5.09)%比(1.82±0.66)%，P<0.05；(21.03±2.97)%比(11.72±1.93)%，P<0.05；(18.07±3.19)%比(4.98±1.20)%，P<0.001；圖3A～3C]，而兩組分泌IL-17的MAIT細胞比例差異無統計學意義[(1.07±0.23)%比(1.10±0.38)%，P=0.962，圖3D]。

注：兩組相比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns為差異無統計學意義

圖3兩組外周血中分泌各種細胞因子的MAIT細胞比例的比較A分泌GrB的MAIT細胞比例B分泌IFN-γ的MAIT細胞比例C分泌TNF-α的MAIT細胞比例D分泌IL-17的MAIT細胞比例

2.5 外周血中MAIT細胞向肝臟趨化能力變化

通過流式細胞術檢測MAIT細胞CXCR6的表達情況，發現與HC組相比，IgG4-SC組外周血中CXCR6陽性的MAIT細胞比例顯著升高[(36.25±6.54)%比(13.53±1.36)%，P<0.001，圖4]。IgG4-SC組MAIT細胞表達趨化因子受體CXCR6升高，提示IgG4-SC患者的MAIT細胞向肝臟趨化增多。

注：兩組相比較，**P<0.01

圖4兩組外周血中CXCR6陽性的MAIT細胞比例比較

3 討論

IgG4-SC是一種好發于60歲以上男性的慢性纖維性炎性疾病，其臨床表現多樣，確診需結合臨床表現、實驗室檢查、影像學和病理學等，以防誤診為惡性腫瘤和其他自身免疫性肝病[2,9]。IgG4-SC是近年被醫學界所認識的新型疾病，其發病機制尚不清楚。以往的研究顯示，適應性免疫細胞和固有免疫細胞如T細胞、B細胞、巨噬細胞在IgG4-SC的發生發展中起著重要的作用[10-13]。

MAIT作為一類免疫細胞，由于其既具有固有免疫細胞的特性，又具有獲得性免疫細胞的功能，故其在臨床和基礎研究中都受到了重視[14-16]。多篇文獻報道MAIT細胞在不同疾病患者的外周血中頻率降低，如自身免疫性肝病[4]、系統性紅斑狼瘡[17]、炎癥性腸病[8]和NAFLD[5]等。在這些研究中，外周血中MAIT細胞頻率降低均伴隨著炎性反應部位(如發生炎性反應的腸道黏膜或肝臟)MAIT細胞頻率升高。在本研究中，外周血中MAIT細胞被定義為CD3+Vα7.2+CD161high淋巴細胞。MAIT細胞主要包括CD8+MAIT、DN MAIT以及少量的CD4+MAIT[3]。通過流式細胞術發現IgG4-SC組的外周血MAIT細胞頻率較HC組降低，同時MAIT細胞分泌細胞因子的功能亦發生改變，分泌GrB、IFN-γ和TNF-α等細胞因子能力的增強，而兩組分泌細胞因子IL-17的能力差異無統計學意義。MAIT細胞在不同疾病中呈現的功能與基礎狀態也有差異性。有研究報道MAIT細胞在疾病狀態中分泌的細胞因子由Th1型向Th17型轉變[6,18]；也有研究發現小鼠MAIT細胞在體外被激活后，可分泌INF-γ、IL-4、IL-5和IL-10[19]；這些不同疾病中MAIT細胞功能的差異提示，其在不同疾病中發揮的生物學功能可能不盡相同。由于缺乏IgG4-SC患者的肝臟標本，故無法通過免疫熒光激光共聚焦技術或流式細胞術等方法確定IgG4-SC組肝臟中MAIT細胞頻率是否較HC組升高。此外，目前尚無理想的IgG4-SC動物模型，故無法利用動物實驗來判斷MAIT細胞是否在肝臟部位聚集。有研究顯示，趨化因子受體CXCR6在自身免疫性肝病患者的淋巴細胞遷移到肝臟中起著重要作用[20]。相較于HC組，IgG4-SC組MAIT細胞高表達CXCR6，提示IgG4-SC患者外周血中MAIT細胞極可能被募集到炎性反應部位。此外，在本研究中IgG4-SC組外周血MAIT細胞頻率降低與ALT、AST和GGT等實驗室指標密切相關。

綜上所述，本研究探究了IgG4-SC患者外周血中MAIT細胞的表型和功能改變，以及MAIT細胞頻率與實驗室指標的相關性。本研究的局限性在于臨床樣本數量少以及缺乏肝臟標本，本研究結果有待今后的多中心、大樣本研究來證實。MAIT細胞在IgG4-SC疾病發生、發展過程中發揮著重要作用，有望在將來成為治療IgG4-SC的新的免疫細胞靶點。