中草藥添加劑對熱應激虹鱒部分生化指標及激素水平的影響

馮淇元 ，線婷 ，王荻 ，劉紅柏

（1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；3.南京農業大學無錫漁業學院，江蘇 無錫 214081）

虹鱒Oncorhynchus mykiss生長適宜水溫為12～18℃，最適水溫為16～18℃，低于8℃或高于20℃時食欲減退、停止攝食，尤其在高溫環境下耐受性低、敏感度高，為典型冷水魚類[1,2]。

溫度是影響水產生物生長、代謝和發育的重要環境因子。虹鱒作為變溫動物對水溫的變化較為敏感，雖然其可適應一定變溫環境，但卻存在承受范圍，超出范圍就會造成魚體損傷甚至死亡，嚴重制約虹鱒養殖產業的發展[3]。當機體受到高溫刺激時會產生熱應激反應，非特異性免疫指標、應激蛋白和組織結構發生變化[4-11]。隨著全球變暖，水產動物熱應激現象頻繁產生。為改善熱應激阻礙虹鱒健康養殖的發展，從天然、毒副作用小、可替代抗生素的中草藥入手不失為一種突破壁壘的途徑[12,13]。中草藥含有維生素、蛋白質、氨基酸等營養物質和生物堿、多糖以及多種免疫活性物質，可使魚抗熱應激[14-17]。管標、何福林等[18,19]研究發現，熱應激可使虹鱒生理生化指標發生變化，如肝臟組織受損等。孫裔雷等[20]在飼料中添加茵陳等復方制劑，改善了虹鱒肝、脾及腎臟中酶活性，有效提高了虹鱒的抗氧化能力。但是，關于柴胡、藿香及茵陳對魚類熱應激免疫機能的研究較少。馬愛敏等[21]研究了柴胡對美國紅魚Sciaenops ocellatus免疫的影響，發現投喂含有2%柴胡的配合飼料28d后，提高了美國紅魚對哈維氏弧菌的免疫保護率，即有促進美國紅魚免疫功能的作用。

魚類非特異性免疫系統在應激環境中起重要作用[22]。魚類的營養狀況、代謝水平和疾病等與其血液有密不可分的關系，當魚體受到溫度、密度、光照等環境因子脅迫時，其生理及病理會改變，通過血液指標體現出來[23,24]。本實驗所選取的柴胡、茵陳、藿香三種中草藥[25]具有一定的抗應激和免疫促進作用，但其機理和藥理均有不同，通過研究虹鱒熱應激下相關激素、酶及組織結構的變化，可以反映中草藥對虹鱒熱應激過程的影響，為中草藥對水產動物熱應激方面的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗選用健康非免疫虹鱒200尾，平均體質量（30±5）g，來自遼寧省本溪市某虹鱒養殖場。實驗用中草藥均購自黑龍江省哈爾濱市寶豐醫藥，研磨充分后備用；皮質醇（COR）酶聯免疫檢測試劑盒、魚腎上腺素（E）酶聯免疫檢測試劑盒、酸性磷酸酶（ACP）試劑盒和堿性磷酸酶（ALP）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組

實驗分為常溫對照組、變溫對照組、變溫柴胡組、變溫藿香組及變溫茵陳組。在基礎飼料中分別添加柴胡、藿香和茵陳。每組20尾魚，設兩個平行。

1.2.2 藥餌的制備

實驗用中草藥添加劑量參照中藥大辭典等醫藥書籍給出的劑量[25]，換算成魚體質量的添加劑量：茵陳（高濃度組30g/50kg體質量，低濃度組20g/50kg體質量）、藿香（高濃度組15g/50kg體質量，低濃度組9g/50kg體質量）、柴胡（高濃度組18g/50kg體質量，低濃度組12g/50kg體質量）。

準確稱取三種中草藥放入各砂鍋中，參照王荻等[17]的方法制備藥汁，按各自添加量均勻噴灑藥汁于飼料表面后陰干，將制備好的飼料存放于4℃冰箱備用。

1.2.3 熱應激處理及樣品采集

虹鱒在室內循環水族箱（0.90m×0.50m×0.45m）中暫養15d，期間按照魚體質量的3%日投喂全價基礎飼料。暫養后，柴胡組、藿香組及茵陳組按照3%的日投餌率投喂藥餌，常溫對照組及升溫對照組投喂基礎飼料。

樣本一：在15℃水溫下連續投喂7d，停食1d后采集樣。

樣本二：從樣本一時間點緩慢升溫至20℃，采集樣本。

樣本三：持續投喂5d，停食1d，采集樣本。

樣本四：從樣本三的時間點緩慢升溫至25℃，采集樣本。

樣本五：持續投喂3d（期間試驗魚已開始出現死亡），停食1d，采集樣本。

用經0.3g/100mL的肝素鈉潤洗的2.5mL注射器采集實驗魚尾靜脈血液。血樣轉移至離心管，在4℃下3 500r/min離心10min，吸取上層即為血漿，存于-20℃冰箱中備用。采集的虹鱒肝臟置于凍存管中，-20℃保存備用。另采集虹鱒的肝臟在波恩試液中固定，以用于制作組織切片。

1.2.4 各項指標的測定

將實驗魚的組織樣本與預冷的生理鹽水混合，按不同檢測指標和試劑盒說明書要求，在冰上用高速分散勻漿機充分勻漿，取上清液進行檢測。-20℃保存的血漿水浴融化即可檢測。

按照南京建成生物工程研究所魚皮質醇（Cortisol）酶聯免疫檢測試劑盒、魚腎上腺素（E）酶聯免疫檢測試劑盒的說明書測定各項指標。

1.3 切片的制作與鏡檢觀察

取經波恩試液固定后的組織，在梯度酒精和二甲苯中脫水透明后包埋、切片，蘇木精-伊紅染色（H&E），中性樹膠封片，用生物顯微鏡（Leica DM 4000 B型）進行觀察、拍照。

1.4 數據處理

數據采用SPSS 19.0軟件中的單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行統計，通過鄧肯氏法多重比較分析組間差異顯著性，以P＜0.05為顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 柴胡、藿香及茵陳對熱應激下虹鱒血漿中皮質醇（COR）和腎上腺素（E）含量的影響

由圖1可知，在15℃正常水溫時，三種中藥組虹鱒血漿中COR含量均高于對照組；升至20℃初時，柴胡組魚血漿中COR含量高于對照組，茵陳組魚血漿中COR含量低于對照組，而藿香高、低濃度組魚血漿COR含量均顯著高于對照組（P＜0.05）。20℃持續熱應激后，柴胡高濃度組、藿香低濃度組及茵陳低濃度組魚血漿COR含量明顯高于對照組。升溫至25℃初時，柴胡組和藿香組魚血漿COR含量明顯高于對照組，茵陳組與對照組無明顯差異（P＞0.05）。25℃持續熱應激后，藿香低濃度及茵陳組魚血漿COR含量明顯高于對照組。在整個熱應激期間，各中藥組魚血漿COR含量先上升后下降，但藿香及茵陳組COR含量的降幅小于柴胡組。

圖1 中草藥對熱應激虹鱒血漿中皮質醇（COR）含量的影響Fig.1 The effects of Chinese herbalmedicines on cortisol levels in the plasma of rainbow trout exposed to heat stress

圖2 中草藥對熱應激虹鱒血漿中腎上腺素（E）含量的影響Fig.2 The effects of Chinese herbalmedicine on epinephrine levels in the plasma of rainbow trout exposed to heat stress

由圖2可知，在15℃正常水溫時，柴胡組、藿香低濃度組及茵陳組虹鱒血漿E含量高于對照組；升溫至20℃初時，柴胡低濃度組、茵陳高濃度組及對照組魚血漿E含量有所升高，但柴胡低濃度組和茵陳高濃度組魚血漿E含量均高于對照組。20℃持續熱應激后，藿香組魚血漿E含量呈上升趨勢，茵陳低濃度組魚血漿E含量明顯升高，對照組魚血漿E含量呈下降趨勢。升溫至25℃初時，各組魚血漿E含量均有所升高，其中柴胡組及藿香組魚血漿E含量上升幅度明顯，且均高于同時期對照組。25℃持續熱應激后，各組魚血漿中E含量均下降，其中柴胡組魚血漿E含量下降幅度最大，而藿香組和茵陳組魚血漿E含量仍高于對照組。

2.2 柴胡、藿香及茵陳對熱應激下虹鱒肝臟中酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（ALP）活性的影響

由圖3可知，15℃正常水溫組和升溫至20℃組相比，肝臟中ACP活性沒有明顯變化。20℃持續熱應激后，除茵陳高濃度組外，各組肝臟ACP活性有所升高外，其余呈下降趨勢，且對照組的下降幅度最大。升溫至15℃初時，柴胡組肝臟ACP活性有所升高，茵陳高濃度組肝臟ACP活性明顯降低。25℃持續熱應激后，柴胡組肝臟ACP活性降低，而藿香組及茵陳組肝臟ACP活性有所升高，均高于同時期對照組。

由圖4可知，15℃正常水溫組與升溫至20℃初相比，各組肝臟中ALP活性均有所降低，各組間無明顯差異。20℃持續熱應激后，中草藥組和對照組肝臟中ALP活性均有所升高，且柴胡組和對照組升高較明顯。升溫至25℃初時，各組肝臟中ALP活性有所下降，且對照組的下降幅度最大。25℃持續熱應激后，茵陳高濃度組肝臟ALP活性顯著高于其余各組（P＜0.05）。

2.3 柴胡、藿香及茵陳對熱應激下虹鱒肝臟組織變化的影響

由圖5可知，隨著溫度的升高，對照組和實驗組出現不同程度的受損，具體表現如下。

正常水溫15℃時：對照組和茵陳組魚肝細胞的肝索及肝血竇分布規則（圖5A，圖5D）。柴胡組和藿香組魚肝細胞、細胞核清晰完整，竇間隙分布規則（圖5B，圖5C）。各實驗組及對照組均無實質性肝損害。

圖3 中草藥對熱應激虹鱒肝臟中酸性磷酸酶（ACP）活性的影響Fig.3 The effects of Chinese herbalmedicines on acid phosphatase activity in the liver of rainbow trout exposed to heat stress

圖4 中草藥對熱應激虹鱒肝臟中堿性磷酸酶（ALP）活性的影響Fig.4 The effects of Chinese herbalmedicine on alkaline phosphatase activity in the liver of rainbow trout exposed to heat stress

初升溫到20℃時：對照組魚肝細胞排列無序，呈明顯空泡化，肝細胞萎縮，核偏移。同時，肝血竇擴張，血細胞數目增加（圖5E）。柴胡組肝細胞結構完整清晰，核略偏移而消失（圖5F）。藿香組魚肝細胞呈明顯空泡化，肝細胞排列無序，細胞核融合，肝血竇擁堵（圖5G）。茵陳組肝細胞結構完整且清晰，部分肝細胞核偏移，無明顯病變（圖5H）。

持續20℃熱應激后：對照組魚肝細胞空泡化嚴重，肝細胞排列無序，肝血竇擴展伴隨炎性細胞浸潤（圖5I）。柴胡組竇間隙擴大，肝細胞結構模糊（圖5J）。藿香組肝細胞結構完整，部分肝細胞核偏移，伴有炎性細胞浸潤（圖5K）。茵陳組肝細胞結構較完整，肝血竇堵塞，部分肝細胞融合（圖5L）。

持續25℃熱應激后：對照組空泡化嚴重，伴有炎性細胞浸潤，肝細胞核溶解、消失（圖5M）。柴胡組呈現空泡化，細胞排列紊亂，部分肝細胞融合（圖5N）。藿香組肝血竇擴張，部分肝細胞融合（圖5O）。茵陳組空泡化嚴重、肝細胞溶解，炎性細胞浸潤（圖5P）。

3 討論

3.1 柴胡、藿香及茵陳對熱應激下虹鱒皮質醇（COR）、腎上腺素（E）含量的影響

圖5 中草藥對熱應激虹鱒肝臟組織形態的影響Fig.5 The effects of Chinese herbal medicines on liver morphology of rainbow trout under heat stress

虹鱒為典型的變溫水生動物，水溫升高影響虹鱒血漿中皮質醇（COR）的含量。COR為應激反應中產生的一種類固醇激素，可以促進糖原、脂質及蛋白質的分解，為機體提供更多能量，以維持正常生理機能[26,27]。研究發現，細胞內不是儲存COR的主要場所，當熱應激時會促使機體向血液中釋放大量COR，加快機體代謝來抵抗熱應激。血液中COR濃度是反映魚體應激強度的重要指標[28-30]。

本研究結果顯示，在15℃正常水溫時，三種中草藥均可提高虹鱒血漿中COR含量，這為機體抵抗熱應激提供了良好的基礎。水溫初升溫到20℃時，藿香促進了機體向血漿中釋放COR的量來抵抗熱應激，而柴胡組的作用效果次之，茵陳組血漿中COR含量低于對照。這說明此熱應激階段藿香組的抗應激效果要好于柴胡組，而茵陳沒有發揮藥效。20℃持續熱應激后，柴胡高濃度組、藿香低濃度組及茵陳低濃度組血漿中COR含量高于對照組，起到了穩定虹鱒生理機能的作用[27]。而持續25℃熱刺激后，柴胡組、藿香高濃度組與對照組COR含量趨于一致，而藿香低濃度組、茵陳組COR含量明顯高于柴胡組和對照組，這說明藿香低濃度組及茵陳組在25℃持續熱應激期間仍能發揮良好的抵抗熱應激的作用。

腎上腺素（E）作為一種激素和神經傳送體，通過抑制蛋白質降解間接起到增多蛋白質合成量的作用[31]，供給機體更多的能量。有報道稱，當魚類受到熱應激刺激后，魚體第一時間出現交感-嗜鉻組織系統反應，血液中腎上腺素含量升高[32]。

本研究表明，在升溫至20℃初的過程中，柴胡低濃度組及茵陳高濃度組均提高了機體E含量，供給機體更多的能量來參與抵抗熱應激，維持機體正常的生命活動。當20℃的水溫持續刺激后，對照組魚的E含量顯著降低（P＜0.05），而各中草藥組魚仍可維持E含量穩中有升；藿香組及茵陳低濃度組魚血漿中E含量上升幅度更大。說明機體自身合成的腎上腺素含量不足以供給機體抵抗20℃的熱應激，而藿香和茵陳組能有效促進機體生成更多的腎上腺素來提供能量。25℃持續熱刺激后，機體激素水平趨于穩定，藿香組和茵陳組魚血漿中E含量均高于對照組，說明藿香和茵陳比對照組仍能保持機體腎上腺素的較高水平，有助于機體在熱應激環境中維持穩定。本實驗中藿香、茵陳能提高腎上腺素含量。

3.2 柴胡、藿香及茵陳對熱應激下虹鱒酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（ALP）活性的影響

魚類處于應激狀態下會改變一些酶活性，調節機體新陳代謝，以抵抗應激對機體的損傷。酶活性高低與組織器官的代謝水平及功能相關，而機體適應應激環境的能力取決于各組織器官的健康水平，其中酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（ALP）即為兩種重要的調節酶。ACP活性高低與核酸和蛋白質的組織退變代謝有關，ACP活性增強時機體核酸和蛋白質代謝活動也增強[33]。ACP還可以參與磷酸酯的代謝、神經遞質的釋放，在疾病免疫、細胞損傷與修復等具有一定作用[34]。因此，ACP活性高低可以反應魚類抵抗應激能力的強弱。

本研究中，在15℃正常水溫下，除茵陳高濃度組外，三種中草藥組虹鱒肝臟中ACP活性均低于對照組，初升溫至20℃時，柴胡低濃度組、藿香低濃度組、茵陳低濃度組ACP呈上升趨勢，而對照組肝臟中ACP活性下降明顯。這說明溫度的升高導致對照組不能夠維持機體正常酶活性，而各中草藥組起到了穩定機體酶活性的作用。20℃持續熱刺激后，茵陳高濃度組ACP活性與其余各組明顯不同。但升溫至25℃初時，茵陳高濃度組ACP活性有所降低，而柴胡組和藿香組呈上升趨勢，且25℃持續熱應激后，藿香組肝臟中ACP仍保持較高活性，說明藿香提高虹鱒肝臟中ACP活性的效果較好。

ALP為溶酶體的重要組成部分，不僅參與魚類的生長發育，加速物質的吸收和利用，還可以為ADP磷酸化為ATP提供更多的無機磷，為抵抗不利環境提供機體所需能量。因此魚類應對熱應激時其ALP可以作為重要的考察指標。本研究中，在15℃至升溫到25℃初期，對照組和各實驗組ALP活性基本維持在較低水平，在持續20℃熱刺激后有小幅度升高，但沒有明顯的變化規律。而持續25℃熱應激一段時間后，茵陳高濃度組ALP活性與其余各組形成顯著性差異（P＜0.05），而其余中草藥組魚肝臟中ALP活性仍無明顯變化。這可能是由于ALP活性偏低有助于組織細胞生理活動處于較低水平，以適應應激環境[34]。熱應激期間，藿香組相比其余各組肝臟中ALP活性更穩定。

3.3 柴胡、藿香及茵陳對熱應激下虹鱒肝臟組織結構的影響

本研究中，對照組魚肝臟隨水溫升高受損嚴重，而中草藥對肝臟損傷起到一定的緩解作用。15℃正常水溫時，各實驗組虹鱒肝細胞分布均勻，肝板排列整齊，虹鱒在此水溫下代謝正常、生存狀況良好；對照組和中草藥組均未出現病理現象，其中藿香組15℃正常水溫下的肝細胞相比其余各組結構更清晰完整。而本實驗中，對照組及茵陳組在15℃條件下肝臟組織中肝小葉結構模糊，這與黃步敏等[35]得到的結構相似，虹鱒肝小葉間結締組織與哺乳動物不同，故肝小葉分界不明顯。之前的研究結果顯示，熱應激可導致虹鱒肝臟組織結構受損[10,36]。周彥靜等[11]對虹鱒進行持續熱應激，其肝臟組織結構變化；當水溫達到21℃時，肝臟輕微淤血，肝細胞輕度變性，但肝臟結構仍然完整清晰。這與本實驗結果相似，20℃持續熱應激一段時間后，對照組肝血竇擁堵，肝板排列紊亂，肝細胞空泡化，各中草藥組出現輕微病變，如輕微淤血，細胞變性等。說明機體對水溫升高做出了反應，但20℃的水溫并未對中草藥組肝臟組織造成嚴重損傷，說明中草藥組可以維持機體肝臟部分結構穩定，起到一定程度抗熱應激作用。崔彥婷[37]研究了不同濃度大黃素對熱應激草魚肝細胞活力的影響，發現0.04μg/mL大黃素濃度組細胞活力顯著高于高溫應激組（P＜0.05）,保護免受氧自由基的損傷，抑制肝細胞凋亡，對熱應激起到一定抵抗作用。本研究中，25℃熱應激情況下，對照組空泡化現象嚴重，肝細胞變性程度不斷加深，肝細胞壞死凋亡，肝細胞結構紊亂等。茵陳組魚大面積肝細胞凋亡壞死，肝細胞空泡化嚴重。而柴胡組和藿香組出現輕微肝細胞空泡化，肝血竇擴張、擁堵，肝細胞融合，細胞核溶解等現象。這與周彥靜在高溫應激時的結果相吻合[11]。整體而言，藿香組魚肝臟在25℃持續熱應激時的破壞程度最小，說明飼料中添加藿香能提高虹鱒抗熱應激損傷的能力。

3.4 小結

魚用中草藥的劑量選擇是根據中藥藥典中各藥物的常用量，因藥物和復方不同而異。目前沒有魚的常用量，以人的常用量為標準，除以平均體質量，得到的適宜應用量[25,38]。在水產中的應用和試驗研究證明，基本適用于部分魚類，包括虹鱒[20]。

本研究中，在熱應激期間，藿香和茵陳組的激素和酶活性整體高于對照組，而柴胡組雖能提高機體抗熱應激能力，但作用效果不理想，其劑量有待進一步研究。結合組織學結果表明，藿香組緩解熱應激的肝損傷的效果更好，可作為虹鱒抗熱應激中草藥的備選藥物。