我國幾種特色果酒專用酵母的研究進展

祖 瑗，鐘小祥，李進強，劉曉柱，劉曉輝，黃名正，于志海*

（貴州理工學(xué)院 食品藥品制造工程學(xué)院，貴州 貴陽 550003）

特色果酒是指具有地域特色的非葡萄發(fā)酵酒。市場上現(xiàn)有無花果酒、刺梨酒、獼猴桃酒、桑葚酒、藍莓酒等特色果酒，但市場占有率都很小。特色果酒的小市場除了跟果酒的消費習(xí)慣有關(guān)外，其中一個很重要的原因就是當(dāng)前果酒的低品質(zhì)屬性。酵母是果酒釀造的靈魂，是決定果酒品質(zhì)、口感和風(fēng)味的重要因素。在當(dāng)前小市場的特色果酒中，幾乎全是采用商業(yè)化的葡萄釀酒酵母發(fā)酵而來，而未見利用特色果酒專用酵母進行釀制而成。在生態(tài)進化過程中，特色水果與自身酵母之間經(jīng)過了長期的自然選擇，是最佳搭檔。只有將這些最佳搭檔篩選出來，應(yīng)用于生產(chǎn)中才有可能推動特色果酒產(chǎn)業(yè)的優(yōu)質(zhì)發(fā)展。因此優(yōu)質(zhì)酵母菌株的篩選和培育是果酒釀造的核心技術(shù)，也是制約特色果酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大科學(xué)問題。值得慶幸的是，國內(nèi)外（特別是國內(nèi)）同行在特色果酒專用酵母方面的選育工作從未止步，近10年來有不少特色果酒專用酵母的選育報道。本文主要基于國內(nèi)近10年來的特色專用酵母的選育結(jié)果，結(jié)合當(dāng)前市場的生產(chǎn)實際和研究熱點，將當(dāng)前國內(nèi)同行們的研究結(jié)果作一整理，以期為未來特色果酒專用酵母的選育提供參考。

1 漿果果酒專用酵母的篩選與鑒定

漿果是一類多汁肉質(zhì)單果的統(tǒng)稱，由單心皮或多心皮合生雌蕊形成，含一粒至多粒種子。這類果實種類較多（如葡萄、獼猴桃、藍莓等均屬于此類果實），因多汁肉質(zhì)，適合釀造果酒（如釀酒葡萄）。

與葡萄的農(nóng)藝性狀最接近的漿果當(dāng)屬藍莓，具有豐富的糖含量和高出汁率、果實大小與釀酒葡萄類似[1]，適宜于果酒釀造。伍鶴等[2]從藍莓成熟果實、藍莓葉及藍莓果園的土壤中篩選到了最優(yōu)菌株，鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），該菌株起酵快、發(fā)酵能力強、香氣濃郁、風(fēng)味佳。任春光等[3]從藍莓自然發(fā)酵汁中分離到了4株發(fā)酵性能較好的酵母菌，這4株菌發(fā)酵平穩(wěn)，酒香和果香配比恰當(dāng)，酸味適中，藍莓果酒味濃郁。李丹等[4]從藍莓自然發(fā)酵旺盛期的醪液中分離篩選到了1株粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombeY201505），可產(chǎn)酒精度8%vol。陳小玲[5]從藍莓的成熟果皮及自然發(fā)酵的醪液中分離純化到73株野生菌株，經(jīng)逐級篩選，并與安琪商業(yè)酵母進行對比，選出1株發(fā)酵性能優(yōu)、乙醇耐受性高、SO2耐受性好的菌株，經(jīng)26S rDNA D1/D2區(qū)序列鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，確定該菌株為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），同時對該菌株的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)、最佳澄清劑、果酒穩(wěn)定性等做了較為深入的研究。

桑葚是另一種近年來在專用酵母選育方面研究得較多的果品。當(dāng)前公開報道的可用來進行桑葚果酒發(fā)酵的菌株約6株（見表1）。趙祥杰等[6]以成熟的桑葚果實、桑葉和桑果園土壤為分離源，篩選到了1株優(yōu)良菌株，該菌株起酵快，能耐高濃度的酒精和SO2，可產(chǎn)生酒精度為11.7%vol的果酒。趙祥杰等[7]從桑椹成熟果實、桑葉以及桑果園的土壤中進行桑椹果酒專用酵母的篩選，得到1株發(fā)酵性能優(yōu)良的酵母菌，該菌株能產(chǎn)生11.7%vol的桑葚果酒。潘訓(xùn)海等[8]以桑葚果汁自然發(fā)酵液和桑果園土壤為分離源，分離到了1株優(yōu)良菌株，該菌株起酵快、發(fā)酵過程緩和、產(chǎn)香好，并進行了1 t放大試驗，結(jié)果顯示該菌株可作為桑葚果酒生產(chǎn)酵母。顏雪輝[9]從桑葚的生存環(huán)境中分離到了一株發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株，該菌株可發(fā)酵成酒精度為10.6%vol的桑葚原酒。曹倩雯等[10]以市售桑葚為分離源，從其自然發(fā)酵醪液中分離到42株酵母，經(jīng)過杜氏小管發(fā)酵法初篩、產(chǎn)酒精能力復(fù)篩和耐SO2和香氣活力值三級篩選，最終獲得最優(yōu)菌株，并采用18S rDNA法鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。孫時光等[11]從桑葚（Fructus mori）的自然發(fā)酵醪液中分離到了35株酵母菌，經(jīng)過三級篩選獲得了1株發(fā)酵性能優(yōu)且高級醇產(chǎn)量低的桑葚果酒酵母。該菌株產(chǎn)生高級醇為312.41mg/L，低于安琪商業(yè)化的葡萄酒酵母，并且具有較好的乙醇和SO2耐受性，經(jīng)18S rDNA鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

表1 候選漿果專用酵母的發(fā)酵性能Table 1 Fermentability of candidate special yeasts for berry

獼猴桃是一類富含維生素C（vitamin C，VC）、維生素E（vitamin E，VE）、維生素K（vitamin K，VK）和類胡蘿卜素等營養(yǎng)成分的漿果[12]，一直以來都備受研究者的關(guān)注。周元等[13]以獼猴桃皮為原材料分離到2株酵母，其中一株發(fā)酵活力強，適合作為獼猴桃果酒發(fā)酵的主發(fā)酵菌株，而另一株發(fā)酵得到的果酒香氣獨特，香氣組分含量高，適合作為獼猴桃果酒發(fā)酵的輔助菌株。郝瑤等[14]從獼猴桃中篩選到了1株發(fā)酵能力好、果香酒香濃郁的菌株，經(jīng)26S rDNA鑒定為庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）。蔣成等[15-16]從獼猴桃中獲得了2個菌株，均鑒定為畢赤酵母（Pichia pastoris）。

近10年來，還有一些稀有漿果果品的專用酵母篩選報道。如崔鐵忠等[17]從柿子果皮及柿果園土壤中篩選出了1株適合柿子果酒釀造的酵母菌。左勇等[18]從無花果（Ficuscarica）的果皮和無花果果酒渣中分離到了41株酵母菌，經(jīng)過三級篩選最后獲得1株起酵快、產(chǎn)酒產(chǎn)香均較好的菌株。謝國芳等[19]從火龍果的自然發(fā)酵汁中利用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）顯色法篩選到了1株優(yōu)良酵母菌株，該酵母可耐受較高的糖濃度、SO2濃度和酒精度，可產(chǎn)生具有火龍果典型風(fēng)味的果酒。周興偉[20]對樹莓專用酵母進行了分離研究，從樹莓中分離到了1株SO2耐受力好，產(chǎn)酒率高的優(yōu)勢酵母菌，但是與英聯(lián)馬利阿城酵母菌公司的酵母菌株相比，性能還不夠優(yōu)越。

2 梨果果酒專用酵母的篩選與鑒定

梨果是由合生心皮下位子房與花托、萼筒共同發(fā)育而成的肉質(zhì)果，屬假果。蘋果、梨、山楂、枇杷等屬于該類果實。梨雖然沒有特殊的果香，但是其較高的出汁率和糖含量仍吸引了不少研究者的眼球。近年來有不少從梨果中篩選專用酵母的報道，從梨中分離到的酵母約有6株（見表2）。曹新志等[21]從梨的自然發(fā)酵液中分離到1個酵母菌株，該菌株在梨汁中發(fā)酵力強，產(chǎn)酒度較高，殘?zhí)禽^低，產(chǎn)香較好，完全可作獨立的發(fā)酵菌株使用。陳文學(xué)等[22]從腰果梨和果樹根部土壤中分離得到65株酵母菌，經(jīng)過篩選，最終確定一株最優(yōu)菌株，該菌株能耐300 mg/L的SO2。金磊[23]以梨的果皮和梨園土壤為分離源，分離到了2株特征酵母，包括發(fā)酵性能優(yōu)良的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和產(chǎn)香性能突出的東方伊莎酵母（Issatchenkia orientalis），并且以這兩株酵母為出發(fā)菌株，進行原生質(zhì)體融合育種，最終獲得1個優(yōu)良融合子DJ02，該菌株具有發(fā)酵能力強、產(chǎn)香能力好的雙親優(yōu)點，為適合釀造梨酒的酵母菌株。劉根娣等[24]以冬果梨為富集培養(yǎng)基，從980株野生酵母中篩選分離到1株發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株，經(jīng)26S rDNA D1/D2序列分析法鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。王東玉[25]從海棠果（Calophyllum inophyllum）中分離到了4株酵母，經(jīng)5.8S-ITS區(qū)的PCR/RFLP分析分別鑒定為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和路德類酵母（Saccharomycodes ludwigii）。其中菌株B20具有高耐受性和發(fā)酵性能，可作為海棠果的發(fā)酵專用酵母。石明楊[26]從沙果（Malus asiatica）的表面及發(fā)酵汁中分離到了1株優(yōu)良菌株，經(jīng)26S rDNA D1/D2區(qū)的PCR/RFLP分析，鑒定為畢赤酵母（Pichia pastoris）。

表2 候選梨果專用酵母的發(fā)酵性能Table 2 Fermentability of candidate special yeasts for pome

3 核果果酒專用酵母的篩選與鑒定

核果是由單心皮雌蕊、上位子房形成的果實，亦有由合生心皮雌蕊或下位子房形成。桃、杏、胡桃等屬于該類果實。楊梅是近年來分離到的酵母較多的核果。杜晶等[28]從楊梅果園周邊環(huán)境及楊梅發(fā)酵醪中篩選到了4個菌株，這些菌株在產(chǎn)氣性能、色澤和風(fēng)味方面都比較突出（見表3）。李艷等[29]從青梅（Vatica mangachapoi）中篩選到1株優(yōu)良菌株，該菌株能夠產(chǎn)生酒精度為11.9%vol的青梅果酒，但是其整個酒產(chǎn)品的性能不及葡萄酒酵母BV818，因此該菌株僅僅是一株具有改造潛能的青梅果酒酵母。張陳云等[30]從冬棗發(fā)酵液中篩選的釀酒酵母TN9#為出發(fā)菌，進行了紫外誘變育種研究，最終獲得一株優(yōu)良的冬棗果酒專用菌株，該菌株能產(chǎn)生12.8%vol的果酒，并且能耐18%vol的酒精度。蔣錫龍等[31]從成熟桃表面選育到了1株產(chǎn)酒產(chǎn)香能力達到釀酒生產(chǎn)要求的菌株，經(jīng)26S rDNA分子生物學(xué)手段鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。石明楊[26]從桃的表面及發(fā)酵汁中分離到了1株優(yōu)良菌株，經(jīng)26S rDNA D1/D2區(qū)的PCR/RFLP分析，鑒定為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。岑濤等[32]通過對從芒果果皮上分離到的6株酵母菌的分析發(fā)現(xiàn)，DTM9最適合于芒果果酒的釀造，經(jīng)26S rDNA序列鑒定為海洋嗜殺酵母（Wickerhamomyces anomalus）。許程等[33]從櫻桃果園的土壤中篩選到了1株發(fā)酵性能優(yōu)良的酵母，能耐250 mg/L的SO2，并能保留櫻桃酒的特征風(fēng)味，經(jīng)18S rDNA鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。李凱等[34]從櫻桃中篩選到了1株適合于紅心火龍果發(fā)酵的專用酵母，經(jīng)18S rDNA序列鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

表3 候選核果專用酵母的發(fā)酵性能Table 3 Fermentability of candidate special yeasts for drupe

4 柑果果酒專用酵母的篩選與鑒定

柑果屬單果，特指蕓香科柑桔屬的果實類型。如橙、桔、柚等屬于該類果實。因這類果實含糖量較高，特征風(fēng)味明顯，近年來有一些關(guān)于該類果實釀造果酒，并從柑桔類果實上篩選專用酵母的研究報道。游見明[35]從腐爛桔子中分離得到35株釀酒酵母，從中篩選出3株發(fā)酵性能較優(yōu)良的菌株。編號為F16的菌株在發(fā)酵性能及桔子酒的品質(zhì)方面，總體表現(xiàn)最優(yōu)，可作為桔子酒發(fā)酵用菌種或桔子酒專用菌種選育的出發(fā)菌株。潘訓(xùn)海等[36]以臍橙果汁自然發(fā)酵液和果園土壤為分離源，分離到了1株優(yōu)良酵母，該菌株起酵快、發(fā)酵過程緩和、產(chǎn)香好，可作為臍橙果酒發(fā)酵用酵母。王雪瑩等[37-38]從土壤、甜橙果實表面共分離到138株酵母菌，經(jīng)四級篩選后獲得了發(fā)酵性能優(yōu)良的2株酵母，均鑒定為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。賈瑞楠等[39]從橙汁發(fā)酵液中分離到了1株能產(chǎn)11.75%酒精的優(yōu)良菌株，該菌株能耐250 mg/L的SO2，經(jīng)18S rDNA鑒定為釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）。張大為等[40]從柑橘自然發(fā)酵液中分離到1株產(chǎn)酒精能力和產(chǎn)香能力均較強的菌株，經(jīng)26SrDNAD1/D2區(qū)序列鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。陳清嬋等[41]比較分析了商業(yè)酵母FX10、安琪果酒酵母、高溫釀酒酵母和2株前期從柑橘中分離到的菌株JZ-1、JZ-2對柑橘果酒香氣成分的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JZ-2生香效果最好，安琪果酒酵母發(fā)酵橘子酒的香氣最豐富。

表4 候選柑果專用酵母的發(fā)酵性能Table 4 Fermentability of candidate special yeasts for citrus fruit

5 其他類果實專用酵母的篩選與鑒定

菠蘿是一類聚花果，具有獨特的風(fēng)味，近年來亦有在該類果實上分離專用酵母的報道。胡月英等[42]從成熟的菠蘿表皮和果肉分離得到101株酵母菌，經(jīng)過篩選，最終選到一株最優(yōu)菌株，該菌株在SO2質(zhì)量濃度為300mg/L、pH1.5、乙醇含量為19%時，均能產(chǎn)氣發(fā)酵。且對菠蘿汁的發(fā)酵能力強，菠蘿酒香氣濃郁。匡鈺等[43-44]從菠蘿中篩選到了1株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），由于該菌株耐SO2能力僅為60 mg/L，經(jīng)原生質(zhì)體紫外誘變育種后獲得1株性能較好的菌株H10-15，并進行了活性干酵母的研究。

表5 候選其他類果實專用酵母的發(fā)酵性能Table 5 Fermentability of candidate special yeasts for other fruits

6 結(jié)論與展望

特色果酒專用酵母的篩選、鑒定與培育是果酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展中的核心問題。我國幅員遼闊，有很多特色水果，為特色果酒的釀造提供了豐富的原料。當(dāng)前研究的特色水果種類較多，涉及漿果、梨果、核果、柑果等，幾乎含糖量較高的水果均有相關(guān)專用酵母分離的研究，研究程序一般遵循“三步篩選法”即TTC初選-發(fā)酵能力（杜氏管）復(fù)篩-菌株發(fā)酵試驗（三級篩選）即可篩選到具有一定功能的目標(biāo)菌株，但是對于篩選到的菌株的生理生化性質(zhì)、表觀性質(zhì)等方面較全的研究極少見，影響果酒生產(chǎn)的核心信息如乙醇產(chǎn)量、SO2耐受性、乙醇耐受性等沒有完全刻畫（見表1～表5）。在微生物鑒定方面，單憑ITS、18S rDNA、26S rDNA等常規(guī)方法就可以鑒定到種的水平，作者認(rèn)為證據(jù)是不充分的，要做得更充分準(zhǔn)確，可能還得有掃描電鏡和比較基因組學(xué)證據(jù)（或不同看家基因序列的交互驗證）。另外，菌株研究的延續(xù)性欠佳。大部分菌株在發(fā)表后很難見到后續(xù)研究報道，本來很多文章所發(fā)表的菌株均有很好的發(fā)酵性能，但是由于其后續(xù)的基礎(chǔ)研究缺乏延續(xù)性，導(dǎo)致該菌株很難走到商業(yè)化這一步，這可能是當(dāng)前國內(nèi)所篩選的酵母商業(yè)化率低的重要原因。雖然特色水果的專用酵母與水果本身是經(jīng)歷了長期的自然選擇而形成最佳配合關(guān)系，但是自然來源的菌種資源往往存在一定的缺陷，如乙醇產(chǎn)量不高、耐SO2性能欠佳、凝集性弱、高級醇產(chǎn)量高等問題，只要有相應(yīng)水果來源的菌株，其相關(guān)性狀均可通過基因工程等手段解決，而當(dāng)前研究在這方面投入精力做精細(xì)工作的很少。

實際上，在同一種水果的不同發(fā)育時期的微生物群落是有差異的。因此要想獲得性狀較佳的微生物資源，需要對水果上的菌種進行立體式的篩選，在不同發(fā)育時期、不同小氣候環(huán)境等條件下進行取樣，從其生長的土壤環(huán)境、果實發(fā)酵液中等進行取樣分析。當(dāng)前的酵母分離中酒精的生產(chǎn)量不應(yīng)該是唯一目標(biāo)，產(chǎn)香、降酸、凝集性好等這些來源于非釀酒酵母的性狀也應(yīng)該是科研人員的關(guān)注點，因為這些非釀酒酵母的專屬性跟釀酒酵母一樣，依然能夠影響果酒的風(fēng)味和口感[45]。