酶解法制備薏米汁的工藝優化

馬 丹，楊源源，張煥琴，李秀芳，李豐岳，孫 強

（荊楚理工學院 生物工程學院，湖北 荊門 448000）

薏米又名薏苡仁、苡仁、米仁、川谷，既是一種中藥，又是一種天然美容食品。《中國食療大典》記載：薏米含蛋白質14%，脂肪5%，碳水化合物65%，鈣0.7%，磷0.242%，人體必需的8種氨基酸齊全且比例接近人體需要[1-3]。薏米有健脾補胃，清熱祛濕，降血脂，抗氧化、抗病毒、抗細菌感染，減輕炎癥活性的功效[4]。

近年來，隨著人們保健意識的增強，再加上薏米的藥食同源特性，相關產品的研究與開發也逐漸深入和廣泛。在國外，特別是日本開發出新型薏米食品，其中80%是發酵飲料。我國目前以薏米為原料的加工產品主要有飲料和發酵制品，如薏米酒、薏米乳酸飲料、薏米發酵飲料和薏米醋等[5-6]。國內對薏米中的淀粉大多是采用淀粉酶進行水解得到酶解液，制備薏米飲料。曠慧等[7]以薏米的焙烤溫度、焙烤時間、淀粉酶用量、酶解時間、酶解溫度、酶解pH為實驗因素建立了制備薏米汁的工藝，在此條件下得到的薏米汁中還原糖含量達到1.4818 g/100 g，呈乳白色，香味濃郁、味道純正。周輝[8]研究表明，薏米淀粉糖化的最佳酶解工藝條件為溫度55℃，pH值為6.6，酶添加量300 U/g，在此條件下可生產出品質優良、穩定性好的澄清型薏米汁。薏米中的蛋白質是優質蛋白[9]，韓麗麗[10]對薏米蛋白進行超聲提取，通過中性蛋白酶和堿性蛋白酶聯合酶解薏米得到薏米抗氧化肽，DPPH自由基清除率達到93.21%，證明薏米蛋白酶解后抗氧化活性更強，因而對薏米蛋白進行酶解具有重要的意義。木瓜蛋白酶對許多蛋白質都有水解作用，具備酶活性高、熱穩定性好、無毒副作用、天然衛生安全等特點，并且資源豐富，取材簡便[11-13]，因此，可利用木瓜蛋白酶對薏米蛋白進行水解。

本項目通過采用α-淀粉酶和木瓜蛋白酶先后對薏米中富含的淀粉及蛋白質進行水解，以還原糖含量和氮溶解指數（nitrogen solubility index，NSI）為檢測指標，采用單因素及正交試驗優化淀粉酶及蛋白酶酶解工藝條件，獲得富含還原糖和可溶性氮的薏米汁。初步探討兩種酶的聯合應用，為薏米飲品深加工技術提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薏米（荊門市東寶區種植）：市售；α-淀粉酶（1000U/g）：北京索萊寶科技有限公司；木瓜蛋白酶（酶活10 000 U/g）：鄭州升達食品添加劑有限公司；鄰苯二甲酸氫鉀（分析純）：天津市福晨化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

DK-98-11A電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；JY1002電子天平：上海上天精密有限公司；KDN-103F凱氏定氮儀：上海纖檢儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 薏米汁加工工藝流程及操作要點

薏米→篩選→清洗→烘干→粉碎→調漿→淀粉酶酶解→滅酶→木瓜蛋白酶酶解→滅酶→離心→成品

新鮮薏米，將其洗凈后進行烘干，將薏米顆粒粉碎至80目，用純水將薏米粉調成漿，分別用α-淀粉酶和木瓜蛋白酶進行兩步酶解，滅酶后離心，過濾，所得濾液即薏米汁終產品。

操作要點[14-16]：

篩選：要求薏米仁粒飽滿，色白，無蟲蛀，無霉斑，脫殼完全，除去殘留殼和砂礫等雜質。

清洗：將篩選過的薏米用清水洗凈，進一步除去細小雜質，將水瀝干。

烘干：將薏米在烘盤上攤薄，放入烘箱，在60℃條件下干燥備用。

粉碎：將薏米用粉碎機粉碎，再過80目篩，過篩后的薏米粉置于干燥的容器中，低溫避光保藏。

調漿：將薏米粉按料水比為1∶10（g∶mL）調成漿，于90℃水浴加熱至完全糊化，冷卻得到薏米漿。

淀粉酶酶解：向冷卻至室溫的薏米漿中加入300 U/g的α-淀粉酶，在65℃條件下酶解3 h。

滅酶：將淀粉酶酶解薏米漿置于100℃水浴中，將淀粉酶滅活。

木瓜蛋白酶酶解：將前述得到的淀粉酶酶解薏米漿中加入100 U/g的木瓜蛋白酶，在50℃條件下酶解6 h。

滅酶：將木瓜蛋白酶酶解薏米漿置于100℃水浴中，將木瓜蛋白酶滅活。

離心：木瓜蛋白酶酶解后，4 000 r/min離心10 min，取上清液，得到薏米汁。

1.3.2 分析檢測

還原糖含量的測定采用堿性銅鹽法中的直接滴定法[17]；氮溶解指數（NSI）的測定[18-20]：取10 mL薏米汁，采用凱氏定氮法測定薏米汁中總氮含量，氮溶指數計算公式如下：

1.3.3 淀粉酶酶解工藝優化單因素試驗

以薏米汁中還原糖含量為評價指標，分別考察酶解溫度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃），酶解時間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h）及酶添加量（100 U/g、200 U/g、300 U/g、400 U/g、500 U/g），通過單因素試驗來確定α-淀粉酶酶解薏米的最適酶解溫度、酶解時間和酶添加量。

1.3.4 淀粉酶酶解工藝優化正交試驗

采用正交試驗設計，用酶解時間（A），酶解溫度（B），酶添加量（C）這3個因素，以酶解后薏米汁中還原糖含量為評價標準，優化酶解工藝條件，正交試驗因素與水平表見1。

表1 淀粉酶酶解條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for enzymatic hydrolysis conditions optimization by α-amylase

1.3.5 蛋白酶酶解工藝優化單因素試驗

向經過α-淀粉酶最佳條件酶解得到的薏米汁中加入木瓜蛋白酶，以氮溶解指數為評價指標，通過單因素試驗分別考察木瓜蛋白酶的酶解溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃），酶解時間（2 h、3 h、4 h、5 h、6 h）及酶添加量（40 U/g、80 U/g、120 U/g、160 U/g、200 U/g），進一步確認木瓜蛋白酶酶解薏米的最適酶解溫度、酶解時間、酶添加量。

1.3.6 蛋白酶酶解工藝優化正交試驗

采用正交試驗設計，以酶解時間（A），酶解溫度（B），酶添加量（C）為評價因素，以酶解后薏米汁中氮溶解指數為評價標準，優化蛋白酶酶解工藝條件，正交試驗因素與水平表見2。

表2 蛋白酶酶解條件優化正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for enzymatic hydrolysis conditions optimization by protease

2 結果與分析

2.1 淀粉酶酶解工藝優化單因素試驗結果

2.1.1 酶解溫度對薏米汁中還原糖含量的影響

α-淀粉酶添加量為250 U/g，酶解時間為2 h的條件下，設置酶解溫度依次為40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，考察酶解溫度對薏米汁中還原糖含量的影響，結果見圖1。

由圖1可知，在α-淀粉酶添加量為250 U/g，酶解時間為2 h的條件下，酶解溫度在40～80℃時，隨著溫度的不斷升高，薏米汁中還原糖的含量也在慢慢升高，并在60℃時達到頂峰。隨后，隨著溫度的升高，薏米汁中還原糖含量逐漸降低，這可能是當溫度高于60℃時，α-淀粉酶部分失活。因此制備薏米汁的最佳淀粉酶酶解溫度為60℃。

圖1 不同酶解溫度對α-淀粉酶酶解薏米汁中還原糖含量的影響Fig.1 Effect of different enzymatic hydrolysis temperature on reducing sugar contents in coix seed juice hydrolyzed by α-amylase

2.1.2 酶解時間對薏米汁中還原糖含量的影響

在α-淀粉酶添加量為250 U/g，酶解溫度為70℃的條件下，設置酶解時間依次為1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，考察酶解時間對薏米汁中還原糖含量的影響，結果見圖2。

圖2 不同酶解時間對α-淀粉酶酶解薏米汁中還原糖含量的影響Fig.2 Effect of different enzymatic hydrolysis time on reducing sugar contents in coix seed juice hydrolyzed by α-amylase

由圖2可知，在α-淀粉酶添加量為250 U/g，酶解溫度為70℃的條件下，酶解時間為1～3 h時，隨著時間的延長，還原糖含量呈上升趨勢，并在3 h時達到頂峰，酶解時間3～5 h時，還原糖含量呈下降趨勢。因此，可以得知制備薏米汁的最佳酶解時間為3 h。

2.1.3 α-淀粉酶添加量對薏米汁中還原糖含量的影響

在溫度70℃，酶解3 h的條件下，設置α-淀粉酶添加量依次為100 U/g 、200 U/g、300 U/g、400 U/g、500 U/g，考察酶添加量對薏米汁中還原糖含量的影響，結果見圖3。

由圖3可知，在酶解溫度70℃，酶解時間3 h的條件下，當α-淀粉酶添加量為100～500 U/g時，隨著α-淀粉酶添加量的增多，薏米汁的還原糖含量也在慢慢增多，并在α-淀粉酶添加量為300 U/g時達到頂峰，此時薏米汁中還原糖含量為18.9 mg/mL。隨后，當α-淀粉酶添加量繼續增大，薏米汁中還原糖含量并不增加。因此，可以得知制備薏米汁的最佳α-淀粉酶添加量為300 U/g。

圖3 不同α-淀粉酶添加量對酶解薏米汁中還原糖含量的影響Fig.3 Effect of different α-amylase addition on reducing sugar contents in coix seed juice

2.2 淀粉酶酶解工藝優化正交試驗結果

根據單因素試驗結果，以酶解時間，酶解溫度，酶添加量為試驗因素，還原糖的含量為評價指標，利用正交試驗優化用淀粉酶酶解制備薏米汁的最佳酶解條件，正交試驗結果與分析見表3，方差分析見表4。

表3 α-淀粉酶酶解條件優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for enzymatic hydrolysis process optimization by α-amylase

由表3可知，3個因素對酶解的效果影響順序是A＞B＞C，其中酶解溫度（A）對試驗效果影響最大，酶解時間（B）其次，酶添加量（C）對酶解的效果影響最小。綜合考慮各因素k值和R值比較，得到最佳因素水平為A2B3C3，即酶解溫度65℃，酶解時間3.5 h，淀粉酶添加量300 U/g。在此最佳條件下進行3次平行驗證試驗，結果薏米汁中還原糖含量平均值為23.26 mg/mL。由表4可知，酶解溫度和酶解時間對結果有顯著影響（P＜0.05），而酶添加量對結果沒有顯著影響（P＞0.05）。

表4 α-淀粉酶酶解工藝優化正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results of enzymatic hydrolysis process optimization by α-amylase

2.3 木瓜蛋白酶酶解工藝優化單因素試驗結果

2.3.1 酶解溫度對薏米汁中氮溶解指數的影響

將經過淀粉酶最佳酶解條件所得的薏米汁在木瓜蛋白酶添加量為120 U/g，酶解時間為3 h條件下，設置酶解溫度依次為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，以酶解后薏米汁中氮溶解指數為評價指標，結果見圖4。

圖4 不同酶解溫度對木瓜蛋白酶酶解薏米汁氮溶解指數的影響Fig.4 Effect of different enzymatic hydrolysis temperature on nitrogen solubility index of coix seed juice hydrolyzed by papain

由圖4可知，經過淀粉酶最佳酶解條件所得的薏米汁在木瓜蛋白酶添加量為120 U/g，酶解時間為3 h的條件下，隨著溫度的不斷升高，薏米汁中氮的含量也在慢慢升高，并在50℃時達到頂峰。隨后，隨著溫度的升高，薏米汁中氮溶解指數逐漸降低。因此，制備薏米汁的最佳酶解溫度為50℃。

2.3.2 酶解時間對薏米汁中氮溶解指數的影響

將經過淀粉酶最佳酶解條件所得的薏米汁在木瓜蛋白酶添加量為120 U/g，酶解溫度為50℃的條件下，設置酶解時間依次為2 h、3 h、4 h、5 h、6 h，以酶解后薏米汁中總氮溶解指數為指標，結果見圖5。

圖5 不同酶解時間對木瓜蛋白酶酶解薏米汁氮溶解指數的影響Fig.5 Effect of different enzymatic hydrolysis time on nitrogen solubility index of coix seed juice hydrolyzed by papain

由圖5可知，將經過淀粉酶最佳酶解條件所得的薏米汁在木瓜蛋白酶添加量為120 U/g，酶解溫度為50℃條件下，隨著時間的提高，氮溶解指數呈上升趨勢，并在5 h時達到平衡，之后一直處于平衡狀態，氮溶解指數不變。因此，可以得知木瓜蛋白酶最佳酶解時間為5 h。

2.3.3 酶添加量對薏米汁中氮溶解指數的影響

經過淀粉酶最佳酶解條件所得的薏米汁在木瓜蛋白酶酶解時間為3 h，酶解溫度為50℃條件下，設置木瓜蛋白酶添加量依次為40 U/g、80 U/g、120 U/g、160 U/g、200 U/g，以酶解后薏米汁中氮溶解指數為評價指標，結果見圖6。

圖6 不同木瓜蛋白酶添加量對酶解薏米汁氮溶解指數的影響Fig.6 Effect of different papain addition on nitrogen solubility index of coix seed juice

由圖6可知，經過淀粉酶最佳條件酶解所得的薏米汁在木瓜蛋白酶酶解時間為3 h，酶解溫度為50℃的條件下，隨著木瓜蛋白酶添加量的增多，薏米汁的氮溶解指數也在增大，并在酶添加量為80 U/g時達到頂峰，此時薏米汁中氮溶解指數為82%。隨后，當蛋白酶的添加量繼續增大，薏米汁中氮溶解指數并不增加，因此，可以得知制備薏米汁的最佳木瓜蛋白酶添加量為80 U/g。

2.4 木瓜蛋白酶酶解工藝優化正交試驗結果

根據單因素的試驗結果，再以酶解時間，酶解溫度，酶添加量為試驗因素，以氮溶解指數為評價指標，利用正交試驗優化用木瓜蛋白酶酶解制備薏米汁的最佳酶解條件，所得的正交試驗結果見表5，方差分析見表6。

表5 木瓜蛋白酶酶解工藝優化正交試驗結果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal experiments for enzymatic hydrolysis process optimization by papain

表6 木瓜蛋白酶酶解工藝優化正交試驗結果方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal experiments results for enzymatic hydrolysis process optimization by papain

由表5可知，3個因素對酶解的效果影響順序為B＞A＞C，即酶解時間＞酶解溫度＞酶添加量。綜合考慮各因素k值和R值比較，得到最佳酶解工藝組合為A2B3C3，即酶解溫度50℃，酶解時間6 h，蛋白酶添加量100 U/g。在此最佳條件下進行3次平行驗證試驗，結果薏米汁中氮溶解指數平均值為79.58%。由表6可知，3個因素均對結果有顯著影響（P＜0.05）。

3 結論

通過單因素試驗和正交試驗，采用淀粉酶和木瓜蛋白酶結合的兩步酶解法制備薏米汁的最佳工藝條件為：α-淀粉酶酶解時間3.5 h，酶解溫度65℃，α-淀粉酶添加量300 U/g；木瓜蛋白酶酶解時間為6 h，酶解溫度為50℃，木瓜蛋白酶添加量為100 U/g。在此最佳酶解工藝條件下，薏米汁中還原糖含量達23.26 mg/mL，氮溶解指數達到79.58%。