大豆水溶性蛋白提取工藝優(yōu)化

郝怡寧，初晨露，陳尚兵，陸晨浩，邢常瑞，袁 建

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,南京 210023)

大豆在我國(guó)常被用來(lái)制作豆制食品，可用于榨取大豆油、釀造醬油，或用于生產(chǎn)大豆蛋白[1]。大豆是一種極好的蛋白質(zhì)來(lái)源，大豆蛋白質(zhì)占大豆總質(zhì)量的30%～50%，新收獲的大豆通常90%以上的蛋白質(zhì)均溶于水，這部分蛋白質(zhì)被稱(chēng)為水溶性蛋白[2]。大豆水溶性蛋白主要由大豆球蛋白和大豆清蛋白組成，隨著大豆新鮮度的降低，大豆中的水溶性蛋白含量逐漸降低。通常來(lái)說(shuō)，水溶性蛋白含量可作為大豆是否適合儲(chǔ)存的重要判定指標(biāo)[3]。

目前，測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法主要有凱氏定氮法、燃燒定氮法、近紅外光譜法、考馬斯亮藍(lán)法、雙縮脲法、紫外吸收法等，其中測(cè)定大豆蛋白含量的主要方法是凱氏定氮法和考馬斯亮藍(lán)法。現(xiàn)有測(cè)定大豆水溶性蛋白含量的方法主要有NY/T 1205—2005、GB/T 19541—2017 和GB/T 31785—2015。NY/T 1205—2005需要對(duì)大豆水溶性蛋白多次提取，步驟較為煩瑣。GB/T 19541—2017附錄A，用氫氧化鉀提取大豆水溶性蛋白的方法雖然過(guò)程簡(jiǎn)單，用時(shí)較短，但穩(wěn)定性較差。GB/T 31785—2015中提取大豆水溶性蛋白的方法，提取率較低。為了簡(jiǎn)化大豆水溶性蛋白提取的操作步驟，提高大豆水溶性蛋白提取過(guò)程中的穩(wěn)定性，減少實(shí)驗(yàn)誤差，本文對(duì)影響大豆水溶性蛋白的提取因素進(jìn)行討論，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得到最佳的提取條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大豆(東北64)：江蘇省農(nóng)科院，于0～4℃儲(chǔ)藏。硼酸(H3BO3)，2 g/100 mL；氫氧化鈉(NaOH)，40 g/100 mL；硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸。

TDL-5-A型離心機(jī)，DKZ系列電熱恒溫振蕩水槽，KX-100型高速多功能粉碎機(jī)，電子天平(0.01 g)，電子分析天平(0.1 mg)，電熱鼓風(fēng)干燥箱,BUCHIK-436快速消解儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆水溶性蛋白的提取

大豆經(jīng)粉碎磨成粉，混勻備用。取一定量(精確到0.001 g)樣品于50 mL離心管中，加入一定量蒸餾水，使勁搖晃使得試樣不結(jié)塊，均勻分散。將離心管固定于水浴鍋在一定溫度下振蕩提取一定時(shí)間。取下離心管，以3 000 r/min離心10 min，將上清液倒入250 mL容量瓶中并定容。

1.2.2 大豆水溶性蛋白含量的測(cè)定

取10 mL樣品液于消化管中，同時(shí)向消化管中加入12 mL濃硫酸和催化劑。消化結(jié)束后采用全自動(dòng)凱氏定氮儀進(jìn)行測(cè)定。

水溶性蛋白含量(w)按下式計(jì)算。

式中:V1為滴定樣品液消化液所耗硫酸的體積，mL；V0為滴定空白液消化液所耗硫酸的體積，mL；C為硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，mol/L；0.014 0為1.0 mL硫酸[C(1/2H2SO4)=1.000 mol/L]標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，g；6.25為大豆含氮量換算成蛋白質(zhì)的系數(shù)；m為10 mL樣品液對(duì)應(yīng)的試樣質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)大豆水溶性蛋白含量的影響

取5.000 g(精確到0.001 g)樣品于50 mL離心管中，取50 mL蒸餾水加入離心管中。將離心管固定至恒溫(35℃)水浴鍋分別振蕩30、60、90、120、150 min。以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液倒入250 mL容量瓶中，定容。考察提取時(shí)間對(duì)大豆水溶性蛋白含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 提取時(shí)間對(duì)大豆水溶性蛋白含量的影響

從圖1可以看出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，大豆水溶性蛋白含量在30～90 min內(nèi)顯著增加，在90 min以后大豆水溶性蛋白含量變化不大，幾乎處于平穩(wěn)。大豆水溶性蛋白與蒸餾水之間的溶質(zhì)濃度的平衡關(guān)系最終決定大豆水溶性蛋白的提取時(shí)間，為了保證大豆水溶性蛋白含量和穩(wěn)定，選擇120 min為最佳提取時(shí)間。

2.1.2 料液比對(duì)大豆水溶性蛋白含量的影響

取1.000 g(精確到0.001 g)磨碎的大豆樣品于50 mL離心管中，分別按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50向其加入蒸餾水，搖勻。在水浴鍋內(nèi)35℃振蕩60 min，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min。取上清液倒入250 mL容量瓶中，定容。考察料液比對(duì)大豆水溶性蛋白含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)大豆水溶性蛋白含量的影響

從圖2可以看出，當(dāng)加水量較低時(shí)，大豆水溶性蛋白不能完全從大豆中析出，有一小部分殘留在殘?jiān)校沟盟苄缘鞍缀科停S著加水量的增加，大豆水溶性蛋白含量整體趨勢(shì)先上升，直到料液比達(dá)到1∶35時(shí)，大豆水溶性蛋白含量才趨于穩(wěn)定。為了確保穩(wěn)定并較為準(zhǔn)確地提取大豆水溶性蛋白，采用料液比為1∶40。

2.1.3 提取溫度對(duì)大豆水溶性蛋白含量的影響

取5.000 g(精確到0.001 g)樣品于50 mL離心管中，加入50 mL蒸餾水，搖勻。在不同溫度(15、20、25、30、35、40℃)的水浴鍋中振蕩60 min，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min。取上清液倒入250 mL容量瓶中，定容。考察提取溫度對(duì)大豆水溶性蛋白含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 提取溫度對(duì)大豆水溶性蛋白含量的影響

從圖3可以看出，提取溫度低于25℃時(shí)，隨著溫度的升高，水溶性蛋白質(zhì)含量明顯上升，當(dāng)提取溫度在25～30℃時(shí)，溫度升高，水溶性蛋白質(zhì)含量有小幅度的提高。因?yàn)殡S著溫度的升高，一些難溶于水的蛋白質(zhì)(如球蛋白)溶解于水，造成水溶性蛋白含量增加。當(dāng)提取溫度在30～40℃時(shí)，大豆水溶性蛋白含量穩(wěn)定。為了提高實(shí)驗(yàn)效率并較為準(zhǔn)確地測(cè)定大豆中水溶性蛋白含量，選擇35℃ 為最佳提取溫度。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以大豆水溶性蛋白含量為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，選擇提取溫度、提取時(shí)間、料液比進(jìn)行三因素三水平L9(34)正交實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表3 方差分析

從表2可以看出，在3個(gè)因素中影響大豆水溶性蛋白含量的最主要因素是提取時(shí)間，其次是料液比，最后為提取溫度，最優(yōu)組合為A3B1C2。綜合各因素作用，最終確定提取大豆水溶性蛋白最佳工藝條件為：提取溫度30℃，提取時(shí)間120 min,料液比1∶40。在最佳工藝條件下，進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得大豆水溶性蛋白含量為34.63%。

從表3可以看出，提取溫度、提取時(shí)間和料液比對(duì)大豆水溶性蛋白含量均有顯著影響，都為主要的影響因素，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 論

以東北大豆為原料，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)，并綜合考慮各因素在實(shí)際中的簡(jiǎn)便、可行性，最終確定大豆水溶性蛋白提取的最佳工藝條件為：料液比 1∶40，提取時(shí)間 120 min，提取溫度 30℃。在最佳工藝條件下，大豆水溶性蛋白含量為34.63%。