不同煎煮時間的銀翹散對小鼠脾臟淋巴細胞體外增殖的影響

張 茹，閆婧璇，劉 玥，于樂海，李美星，常雪菡，鄭志娟

(山東中醫藥大學，山東 濟南 250355)

銀翹散出自清·吳瑭的《溫病條辨》，由金銀花一兩、連翹一兩、苦桔梗六錢、薄荷六錢、竹葉四錢、甘草五錢、荊芥穗四錢、淡豆豉五錢、牛蒡子六錢，蘆根六錢[1]組成，該方具有清熱解毒的功效。霍炳杰等人[2-4]認為煮沸后3min對外周血T細胞亞群影響作用較強，3～6min銀翹散對甲型流感病毒療效最佳。故通過對銀翹散煮沸后0～6min的HPLC譜圖及小鼠脾臟T、B淋巴細胞體外增殖情況探討銀翹散的最佳煎煮時間。

1 儀器及試藥

1.1 儀器

LC-10ATvp型高效液相色譜儀(日本島津公司)，Innoval ODS-2柱(4.6mm×150mm;5μm)；超凈臺；MemmentCO2培養箱(北京五洲東方科技發展有限公司)等。

1.2 藥材

金銀花、連翹、牛蒡子、薄荷、苦桔梗、蘆根、淡豆豉、生甘草、竹葉、荊芥穗，購于安國市久旺藥業有限公司。

1.3 試劑

對照品綠原酸、連翹苷、牛蒡子苷均為分析純購自成都德思特生物技術有限公司，環磷酰胺(CY)，甲醇(色譜純)，磷酸，脂多糖(LPS)，刀豆蛋白(ConA)，噻唑藍(MTT)， RPMI 1640培養基，胎牛血清。

1.4 其他材料

SPF級小鼠，雌性，體重18～22g。

2 方法

2.1 色譜

2.1.1 色譜條件

Innoval ODS-2柱(4.6mm×150mm;5μm)，流動相甲醇(A)-0.05%磷酸水(B)梯度洗脫(0～1min，1%～2%A;10.01～30min，2%～15%A;30.01～50min，15%～20%A;50.01～80min， 20%～40%A;80.01～100min，40%～43%A)，檢測波長237nm，流速1.0mL/min，柱溫30℃。

2.1.2 供試品溶液制備

將上述十種藥品打粉，按照比例(水與總藥量比例為5∶1)提前浸泡1h,然后進行煎煮，煮沸時間分別為0、1.5、3、4.5、6min。

2.1.3 對照品溶液的制備

精密稱取對照品，綠原酸0.0038g，連翹苷0.0046g，牛蒡子苷0.0064g，用甲醇定容。

2.2 細胞實驗

2.2.1 小鼠前期準備

小鼠連續15天注射環磷酰胺(60mg/kg×bw)。

2.2.2 制備小鼠脾臟淋巴細胞

第16天將小鼠頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡3～5min,在超凈臺內分離脾臟，放在盛有適量PBS的培養皿中，剝離脂肪與筋膜組織，置于200目篩網用無菌注射針針芯輕輕研磨，收集細胞懸液，加入Tris-NH4Cl裂解紅細胞，靜置5min，800r/min離心10min[5]，棄上清。收集細胞懸液，稀釋成(2.0×106)mL，備用。

2.2.3 實驗分組

RPMI 1640完全培養液即為含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基[6]。

空白對照組：完全培養液；LPS對照組：完全培養液+10μg/mL LPS；ConA對照組組：完全培養液+10μg/mL ConA；T淋巴細胞組：ConA+不同煎煮時間銀翹散；B淋巴細胞組：LPS+不同煎煮時間銀翹散

2.2.4 MTT法檢測細胞增殖情況

取稀釋好的脾臟細胞懸液100μL置于96孔細胞培養板中，根據2.2.3實驗分組進行加藥，最終每孔體積為200μL，置于37℃、5%CO2培養箱里培養24h后，加入MTT繼續培養4h，每孔吸棄100μL上清液，加150μ LDMSO,混勻，恒溫振蕩5min，酶標儀于570nm處測得吸光度值。

3 結果及討論

3.1 銀翹散及其三種主要成份分析

通過印酬等人[7]推斷銀翹散中主要起作用的為金銀花、連翹、牛蒡子，故選取其三種藥材的主要成分作為對照品(綠原酸、連翹苷、牛蒡子苷)，根據2.1.3配制的對照品進行檢測，峰1、2、3分別為綠原酸、牛蒡子苷、連翹苷。

圖1 三種對照品HPLC譜圖

圖2 樣品HPLC譜圖

峰號 S0 S1 S2 S3 S4 S5 平均 RSD/%10.494 0.506 0.507 0.506 0.505 0.504 0.504 0.96420.966 0.966 0.966 0.964 0.964 0.967 0.966 0.10431.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.000

表2 相對峰面積

3.2 不同煎煮時間銀翹散對小鼠脾臟淋巴細胞增殖影響

由表3可知，不同煎煮時間銀翹散與ConA共同影響免疫抑制小鼠脾臟T淋巴細胞增殖，在1.5min時最佳；與LPS共同影響免疫抑制小鼠脾臟B淋巴細胞增殖，在3min時最佳。

表3 不同煎煮時間銀翹散對免疫抑制、對照小鼠脾臟B/T淋巴細胞增殖的影響

注：同列數據肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，有相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。

4 小結與討論

銀翹散因其某些成分具有揮發性，故不能過度煎煮，把握好煎煮時間便是關鍵。與此同時，劉險峰[8]認為傳統煎煮方法療效較佳，束雅春等人[9]發現在傳統煎煮方法下薄荷、荊芥穗后下煎煮3min、5min效果較好。

本研究通過對銀翹散中三種主要成份的HPLC譜圖的相對保留時間及相對峰面積進行對比，可以得出不同煎煮時間銀翹散中所含成分含量不同；通過對免疫抑制小鼠脾臟淋巴細胞體外增殖可以得出不同煎煮時間的銀翹散對脾臟T、B淋巴細胞體外增殖影響不同。