補腎活血方對不明原因復發性流產患者血清中IL-13、IL-33的影響

馮曉玲， 李強， 李嘉瑋， 尚平， 李楊， 張楊

（1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱 150040）

復發性流產（RSA）是指連續發生2次或者2次以上由于自然因素導致的妊娠不足20周、胎兒體質量不足400g而終止妊娠者，是妊娠12周前最常見的妊娠并發癥，占人類妊娠的1%～2%[1]。RSA已被公認為具有多種原因的全球性問題，包括父母染色體異常、子宮異常、遺傳性血栓形成、內分泌失調、免疫因子和/或感染等。不幸的是，在50%的病例中，RSA的原因仍然未知，該組被定義為不明原因復發性流產（URSA）[2]。URSA是目前臨床比較常見的異常情況，1%～5%的女性受到影響，尤其30歲以上的女性處于風險最高的群體。因此，明確復發性流產病因，制定有效防治URSA的診療方案是醫學界關注的熱點之一。仔細檢查這些URSA病例發現，潛在的免疫學改變主要與胎兒—母體免疫耐受失敗有關。妊娠免疫耐受實質上可認為是一種外周免疫耐受，其依賴于具有多種功能的免疫活性細胞的參與[3]。活化的Th2型細胞主要分泌白細胞介素-10（IL-10）、白細胞介素-13（IL-13）等因子，IL-13是I型免疫反應的反調節系統，并且作為II型細胞因子介導的免疫應答的重要調節劑，在免疫性疾病中發揮重要作用[4]。有研究[5]表明：白細胞介素-33（IL-33）能夠加強Th2型細胞因子的分泌，參與Th2型細胞介導的免疫應答。URSA由于病因不明確，目前臨床上沒有確切的診療方案。

多年來國內外在防治URSA方面的主要治療方法存在很大弊端，不適合廣泛性應用。筆者通過總結前人的智慧結晶和本人在治療復發性流產方面所積累的臨床經驗，認為該病以腎虛血瘀為主，治療以補腎活血為大法，運用補腎活血方治療復發性流產患者，療效頗著。盡管有越來越多的證據表明Th1和Th2平衡在妊娠相關免疫調節中的作用，但確切的機制尚不清楚。因此，本研究進一步探討補腎活血方對復發性流產患者的臨床中醫證候及外周血β人絨毛膜促性腺激素（β-HCG）、孕酮（P）、雌二醇（E2）、IL-13、IL-33等相關指標的影響，現將研究結果報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象及分組 本研究共分兩部分：兩部分試驗病例均為2016年1月～2017年3月來黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院婦產科門診及住院部就診的患者。第一部分：分別選取妊娠6～8周的15例URSA的妊娠失敗患者（URSA組）和15例正常妊娠行人工流產婦女（非URSA組）作為研究對象，觀察其蛻膜組織IL-13受體（IL-13R）和IL-33受體（IL-33R）mRNA含量。第二部分：選取60例URSA妊娠患者，用簡單隨機化方法將其隨機分為試驗組（服用補腎活血方+地屈孕酮）和對照組（服用地屈孕酮），每組各30例，分別采集2組用藥前及用藥4周后的外周血以作相關指標檢測之用。患者年齡23～41歲，平均年齡（30.745 8±4.019 7）歲，停經周數為6～8周，平均孕周為（9.30±1.75）周。

1.2 診斷標準 URSA的西醫診斷標準參照謝幸主編的《婦產科學》[6]中的診斷標準。腎虛血瘀型滑胎的中醫診斷標準參照《中藥新藥臨床研究指導原則》[7]、《中醫婦科學》[8]和《中醫診斷學》[9]。

1.3 納入標準 第一部分研究的納入標準：年齡22～42歲，URSA組符合早期URSA的西醫診斷標準和腎虛血瘀型的中醫診斷標準，且URSA未經任何治療者；非URSA組為正常妊娠，無自然流產史，有1次或1次以上正常生育史，既往生產子女均健康，夫妻無遺傳病史，此次妊娠狀況良好，實驗室指標及超聲檢查正常，要求進行人工流產者。第二部分研究URSA用藥組的納入標準：符合早期URSA的西醫診斷標準和腎虛血瘀型的中醫診斷標準，妊娠6～12周，堅持治療在4周以上的患者。納入者入組前均被告知風險，自愿接受和配合研究并簽署知情同意書的患者。

1.4 排除及脫落標準 第一部分研究的排除標準：URSA組不符合納入病例標準者，胚胎染色體核型分析異常者，復發性流產病因明確者。非URSA組為首次妊娠婦女，有保胎意愿，實驗室指標及超聲檢查有異常者。第二部分研究URSA用藥組的排除標準：不符合納入病例標準，復發性流產病因明確，合并有精神疾患或肝腎功能不全，入院前已服用其他中（成）藥治療的患者。脫落標準：未按規定劑量服用藥物或自行停藥者，發現其他造成復發性流產確切病因者及自行退出或拒絕治療后再次采血者。

1.5 治療方法

1.5.1 對照組 給予地屈孕酮治療。用法：從確定妊娠開始給予口服地屈孕酮片（達芙通，由蘇威制藥有限公司提供，批準文號：國藥準字H20090470），每次1片，每日2次（每12 h服用1次），連續服用4周。

1.5.2 試驗組 給予補腎活血方聯合地屈孕酮治療。（1）地屈孕酮的用法用量同對照組。（2）中藥治療。補腎活血方組成：菟絲子20 g、川續斷20 g、桑寄生20 g、阿膠10 g、黃芪20 g、黨參20 g、丹參10 g。每日1劑，由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院煎藥室統一常規煎取200 mL并分裝為2袋，每袋100 mL，分2次于早晚飯后溫服，持續服用4周。

1.6 觀察指標及檢測方法 第一部分研究：采用逆轉錄—聚合酶鏈反應（RT-PCR）法測定URSA組和非URSA組患者流產蛻膜組織中IL-13R和IL-33R mRNA含量，根據RT-PCR擴增曲線所得出每組及對照內參的Ct值，結果采用比較Ct法定量，并使用2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達量。第二部分研究：安全性指標，檢測2組患者治療前后血尿大便常規、肝腎功能、凝血功能、血離子常規和心肌酶等指標的變化情況，觀察2組患者治療過程中的不良反應及毒副作用情況。療效性指標，采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定2組患者外周血中IL-13、IL-33水平，觀察2組患者治療前后外周血中P、E2、β-HCG的含量變化，評價2組患者的療效并作隨訪。

1.7 療效評價標準 依據國家中醫藥管理局發布的《中醫病證診斷療效標準》[10]制定。治愈：各項檢查證實為正常妊娠，血止胎安，兼癥消失；好轉：漏紅減少，兼癥改善；未愈：出血不止，伴隨癥狀無明顯變化或加重，墮胎流產，或胎死腹中。1.8 統計方法 采用SPSS 22.0統計軟件進行數據的統計分析。計量資料用均數 ±標準差(±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內治療前后比較采用配對樣本t檢驗；計數資料用率或構成比表示，組間比較采用χ2檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 URSA組與非URSA組蛻膜組織中IL-13R、IL-33R mRNA含量 表1結果顯示：在2組流產患者的蛻膜組織中，URSA組的IL-13R、IL-33R mRNA含量均低于正常人流的非URSA組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。說明IL-13、IL-33在蛻膜組織中的低表達水平與URSA的妊娠結局密切相關。

表1 URSA組與非URSA組蛻膜組織中IL-13R、IL-33R mRNA含量比較Table 1 Comparison of IL-13R and IL-33R mRNA contents in the decidual tissue of URSA group and non-URSA group (±s)

表1 URSA組與非URSA組蛻膜組織中IL-13R、IL-33R mRNA含量比較Table 1 Comparison of IL-13R and IL-33R mRNA contents in the decidual tissue of URSA group and non-URSA group (±s)

①P＜0.01，與非URSA組比較

組別非URSA組URSA組P IL-33R 0.59±0.20 0.37±0.21①0.007 N 15 15 IL-13R 1.15±0.18 0.90±0.28①0.007

2.2 2組患者治療前后外周血中IL-13、IL-33含量比較 表2和表3結果顯示：治療前，2組患者外周血IL-13、IL-33含量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。治療后，2組患者外周血IL-13、IL-33含量均較治療前升高（P＜0.01），且試驗組對外周血IL-13、IL-33含量的升高作用優于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。說明補腎活血方聯合地屈孕酮和單獨地屈孕酮治療對腎虛血瘀型URSA患者外周血中IL-13、IL-33的含量均有調節作用，但是補腎活血方聯合地屈孕酮的調節效果要優于單獨地屈孕酮。

2.3 2組患者治療前后外周血中P、E2、β-HCG含量比較 表4結果顯示：治療前，2組患者外周血中P、E2、β-HCG含量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。治療后，2組患者外周血中P、E2、β-HCG含量均較治療前升高（P＜0.01），且試驗組的升高作用均明顯優于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。說明補腎活血方可以有效提高患者外周血中P、E2和β-HCG水平。

表2 2組患者治療前后外周血IL-13含量比較Table 2 Comparison of IL-13 content in the peripheral blood of the two groups before and after treatment[±s，ρ/（ng·L-1）]

表2 2組患者治療前后外周血IL-13含量比較Table 2 Comparison of IL-13 content in the peripheral blood of the two groups before and after treatment[±s，ρ/（ng·L-1）]

①P＜0.01，與治療前比較；②P＜0.01，與對照組治療后比較

0.000 0.000組別試驗組對照組N t P 30 30治療前18.85±2.227 19.02±2.536治療后26.54± 5.296①②23.74±4.973①-8.242-4.516

表3 2組患者治療前后外周血IL-33含量比較Table 3 Comparison of IL-33 content in the peripheral blood of the two groups before and after treatment[±s，ρ/（ng·L-1）]

表3 2組患者治療前后外周血IL-33含量比較Table 3 Comparison of IL-33 content in the peripheral blood of the two groups before and after treatment[±s，ρ/（ng·L-1）]

①P＜0.01，與治療前比較；②P＜0.01，與對照組治療后比較

0.000 0.000組別試驗組對照組N t P 30 30治療前918.763±852.25 792.25±283.01治療后131 8.10± 398.62①②101 9.77±150.11①7.102-4.099

表4 2組患者治療前后外周血中P、E2、β-HCG含量比較Table 4 Comparison of P，E2，β-HCG contents in the peripheral blood of the two groups before and after treatment(±s)

表4 2組患者治療前后外周血中P、E2、β-HCG含量比較Table 4 Comparison of P，E2，β-HCG contents in the peripheral blood of the two groups before and after treatment(±s)

①P＜0.01，與治療前比較；②P＜0.01，與對照組治療后比較

組別試驗組對照組β-HCG[J/（mU·mL-1）]5 652.92±2 434.91 109 889.03± 46 322.84①②6 025.51±3 805.46 56 827.07±24 124.91①N 30 30 30 30時間治療前治療后治療前治療后P[ρ/（ng·mL-1）]20.98±5.01 39.83± 7.61①②21.33±4.50 29.05±4.92①E2[ρ/（pg·mL-1）]495.65±265.30 1 394.86± 530.56①②495.85±252.17 1 034.55±466.08①

2.4 2組臨床療效比較 表5結果顯示：治療4周后，試驗組的總有效率為93.3%，對照組為73.3%；組間比較，試驗組的臨床保胎有效率明顯優于對照組（P＜0.05）。說明補腎活血方可以有效促進胚胎發育和維持正常妊娠。

表5 2組患者臨床療效比較Table 5 Comparison of clinical efficacy in the two groups n（p/%）

2.5 安全性評價 2組患者在治療前后均進行了血、尿、大便常規，血離子常規，肝、腎功能等檢查，結果顯示，在治療過程中，均未發現因服補腎活血方而出現的不良反應及毒副作用，說明本方臨床應用安全可靠。

2.6 隨訪情況 對60例患者進行電話隨訪調查：試驗組2例保胎失敗，8例未分娩；對照組8例保胎失敗，10例未分娩。

3 討論

子宮具有獨特的微環境，免疫系統對復發性流產（RSA）和不孕癥的影響成為當今的研究熱點，通過藥物干預改善免疫失衡可降低胚胎丟失風險[11]，這與本研究的結論不謀而合。成功妊娠依賴于維持Th1細胞和Th2細胞介導的免疫平衡，多項研究證實，Th1/Th2型細胞因子的平衡對正常妊娠維持有著非常重要的作用[12]。抗炎因子IL-13主要由Th2型細胞亞群分泌，是一個多效能的細胞因子，作用于T、B細胞等信號傳導系統，將信號傳導到胞漿，在免疫性疾病中發揮重要作用[4]。病理性降低的IL-13打破母胎界面的Th1/Th2免疫平衡，母—胎免疫耐受無法建立，最終激活細胞凋亡機制而引發流產。IL-33/ST2系統是最近發現的具有多種生物學功能的免疫途徑，在炎癥與自身免疫性疾病尤其是Th1/Th2失調免疫性疾病過程中起著關鍵性的作用[13-15]。IL-33通過與由其特異性主要受體ST2、共同受體和IL-1受體輔助蛋白形成的異二聚體結合而發揮其細胞因子活性。IL-33不含信號序列，不像常規細胞因子那樣分泌。相反，它起到細胞損傷后釋放的內源性危險信號或核警報的作用，在創傷或感染期間組織損傷時提醒免疫系統，細胞壞死引起促炎生物活性釋放，IL-33介導的骨髓和淋巴細胞的刺激支持其增殖和存活，引導遷移和導致其2型免疫介質尤其是IL-5和IL-13的產生[16]。細胞壞死誘導巨噬細胞產生抗炎細胞因子和存活因子[17]。同時巨噬細胞可以通過上調IL-13和Arg-1的表達，產生自分泌M2極化環并增加Th2極化來響應IL-33，最終導致反炎癥反應[18，19]。此外，巨噬細胞來源的IL-33是胎盤生長的關鍵因素，其放松管制可能引起不良妊娠結局，包括RSA和先兆子癇（PE）[20，21]。故提高IL-13、IL-33的表達可減少對胚胎的攻擊，有利于妊娠的順利進行。

目前，不明原因復發性流產（URSA）的中醫病因病機尚存在諸多不同的意見，筆者根據多年的臨床經驗，認為RSA的病因病機雖錯綜復雜，總屬腎虛血瘀，治療上當以補腎活血，予以補腎活血方加減[22]。《醫學衷中參西錄·醫方》曰：“男女生育，皆賴腎臟作強，腎旺自能蔭胎”。王清任在《醫林改錯·下卷》中提出，瘀血為滑胎的病因之一。腎藏精，主生殖，生之本。腎虛沖任不守，氣血運行失暢，瘀血阻礙，屢孕屢墮傷及胞臟而致流產。現代研究認為URSA患者的免疫系統出現異常，多由于血栓狀態形成產生胚胎毒性等而導致流產[23]。大量臨床試驗提示血液的高凝狀態是導致URSA的重要因素之一[24]，運用活血中藥能有效改善患者的高凝狀態，這也為補腎活血法治療URSA提供了理論依據。李佶等[25]對200例RSA患者進行研究，發現補腎活血法可以通過改善血液高凝血栓前狀態，改善胎盤供血能力，提高保胎機率。補腎活血方中菟絲子、川續斷、桑寄生、黃芪、黨參等補腎健脾，丹參、阿膠等活血養血，諸藥相伍，可以調節Thl/Th2免疫平衡，改善內分泌，補腎固胎，活血養血，補而不瘀，共奏補腎活血安胎之功效。

綜上所述，補腎活血方可顯著提高RSA患者的保胎療效，提高血中β-HCG、P、E2水平，上調IL-13、IL-33等炎癥因子水平，從而使促炎細胞因子與抗炎細胞因子保持平衡狀態，維持母胎界面免疫的平衡，改善患者的妊娠結局，且具有毒副作用小，母胎安全系數高的優點，值得臨床廣泛應用。但本研究尚未對補腎活血方治療RSA患者的具體作用機制探查清楚，還有待進一步研究來加以完善。