六味骨痹湯對兔骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織的影響及與軟骨修復(fù)的相關(guān)性研究

李媛， 彭力平， 余闐， 胡烈奎， 賴錦泉， 陳達， 廖州偉， 馬篤軍

[1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，廣東深圳 518033；2.深圳市中醫(yī)院骨傷科一病區(qū)，廣東深圳 518033；3.深圳寶安中醫(yī)院（集團）骨傷科一區(qū)，廣東深圳 518101]

根據(jù)骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）的病理變化，既往對OA治療的研究主要集中在抑制和修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨損傷。近年來不少研究關(guān)注到滑膜炎與OA進展或軟骨損傷的相互作用。抑制滑膜炎癥成為目前治療OA的一個新途徑。OA屬中醫(yī)“痹癥”范疇，本課題組應(yīng)用廣東省名中醫(yī)彭力平教授的經(jīng)驗方“六味骨痹湯”（由淫羊藿、南五加皮、龜甲、懷牛膝、骨碎補及生甘草6味中藥組成）治療腰膝酸痛為主要表現(xiàn)的肝腎虧虛型痹癥，療效顯著。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)OA患者連續(xù)服用六味骨痹湯6周后，其疼痛視覺模擬量表（VAS）評分及Lequesne指數(shù)顯著降低，表明六味骨痹湯可有效緩解OA疼痛癥狀及改善關(guān)節(jié)功能活動[1]；實驗研究結(jié)果表明六味骨痹湯可修復(fù)兔OA模型軟骨的組織形態(tài)[2]。本實驗就六味骨痹湯對OA滑膜組織的影響及其與軟骨修復(fù)的相關(guān)性展開研究，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 3月齡未育清潔級新西蘭兔32只，體質(zhì)量（2.42±0.23）kg，由廣東省實驗動物中心提供，動物質(zhì)量合格證號：（粵）SCXK 2014-0035，飼養(yǎng)于深圳北京大學(xué)/香港科技大學(xué)醫(yī)學(xué)中心動物實驗室（清潔級環(huán)境）。所有對動物的處置方法獲得本單位醫(yī)學(xué)實驗動物倫理委員會批準且符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相關(guān)動物倫理學(xué)標準的條例。

1.2 藥物 六味骨痹湯藥物組成：淫羊藿10 g，南五加皮10 g，龜甲20 g，懷牛膝15 g，骨碎補10 g，生甘草5 g。中藥材購自深圳市中醫(yī)院中藥房，由深圳市中醫(yī)院中藥制劑室統(tǒng)一煎制：每劑中藥煎煮2次，每次1.5 h，后合并2次濾液，低壓濃縮至含藥濃度1 g·mL-1；硫酸氨基葡萄糖膠囊（信東生技股份有限公司，批號：7KO0103）。

1.3 試劑與儀器 木瓜蛋白酶（美國Sigma公司）；白細胞介素1β（IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（批號：AE90731Rb）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒；免疫組化第一抗體Anti-Collagen TypeⅡ（美國Santa公司，批號：E0416）。H1650-W型臺式離心機（美國Thermo公司）；BCD_220UEMA6型低溫冰箱（海爾公司）；BK43型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；EOS600D型顯微照相機（日本Cannon公司）。

1.4 骨關(guān)節(jié)炎造模、分組與給藥 32只實驗兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機選取24只采用關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶法造模[3]。取兔右膝關(guān)節(jié)屈曲位，沿髕骨下極髕腱外緣進針，向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射質(zhì)量濃度為60 g·L-1的木瓜蛋白酶溶液5 mL，屈伸膝關(guān)節(jié)使其充分擴散于關(guān)節(jié)腔，連續(xù)4周分別于每周第1、4、7天注射1次，并每天按時驅(qū)趕動物。對造模完成的24只OA模型兔按隨機區(qū)組法分為模型組、六味骨痹湯組和硫酸氨基葡萄糖組，每組8只；將剩余未造模的8只新西蘭兔設(shè)為正常組。除正常飼料喂養(yǎng)外，其他各組實驗兔均通過灌胃給藥。正常組和模型組每日予生理鹽水10 mL；其他2組分別予溶于等量生理鹽水的藥物。按照人和動物間體表面積的等效劑量比值表計算，六味骨痹湯劑量為3.8 g·kg-1·d-1，硫酸氨基葡萄糖劑量為77.0 mg·kg-1·d-1。灌胃6周，期間每天觀察并記錄實驗兔的一般情況。

1.5 標本采集

1.5.1 關(guān)節(jié)液 給藥結(jié)束后，給予實驗兔造模關(guān)節(jié)處脫毛、消毒，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入生理鹽水1 mL沖洗，充分活動關(guān)節(jié)后抽出1 mL沖洗液，移至EP管，1 000 r·min-1離心10 min，取上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｕ＝M取右膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液方法同上。

1.5.2 關(guān)節(jié)滑膜及軟骨標本 取關(guān)節(jié)液后，處死實驗兔，備皮，用體積分數(shù)0.5%碘伏消毒兔造模關(guān)節(jié)處皮膚后逐層解剖。觀察關(guān)節(jié)大體情況后，切取盡量大的內(nèi)側(cè)滑膜組織作為滑膜標本；剔除其他組織后，將股骨髁部及脛骨區(qū)骨塊整塊切取，保留厚度約1.0 cm，操作及保存時避免損傷關(guān)節(jié)軟骨。取材結(jié)束后，將滑膜組織及軟骨組織標本浸泡于體積分數(shù)為10%的中性福爾馬林液中備用。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 滑膜、軟骨組織形態(tài)學(xué)變化 滑膜及部分軟骨標本切片后行蘇木素—伊紅（HE）染色，高倍鏡下觀察滑膜及軟骨組織形態(tài)。按照Krenn標準[4]，就滑膜細胞排列、血管增生和炎性細胞浸潤等方面對滑膜炎程度進行評分，得分越高滑膜炎癥越重。按照改良Mankin’s法[5]對軟骨損傷程度評分，得分越高軟骨損傷越重。

1.6.2 軟骨Ⅱ型膠原蛋白表達情況 將部分軟骨標本用免疫組織化學(xué)法染色后高倍鏡下觀察，依據(jù)染色強度和面積對關(guān)節(jié)軟骨的Ⅱ型膠原蛋白表達情況進行評分，以每個視野中陽性細胞數(shù)的平均數(shù)計算該切片的陽性細胞百分比進行積分：0%～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；染色強度以多數(shù)陽性細胞呈現(xiàn)的染色特征為標準計分：無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。染色強度：弱染色，在40×物鏡視野才能看到細胞染色；強染色，在4×或10×物鏡視野能看到的細胞染色。綜合得分越高則表明Ⅱ型膠原表達程度越高。

1.6.3 采用ELISA法檢測關(guān)節(jié)液中TNF-α、IL-1β及MMP-13的含量 具體操作步驟按照TNF-α、IL-1β及MMP-13 ELISA試劑盒說明書進行。

1.6.4 滑膜炎與軟骨損傷的相關(guān)性分析 收集數(shù)據(jù)后，應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件對各組實驗兔滑膜炎Krenn評分與軟骨損傷Mankin’s評分、Ⅱ型膠原表達評分進行相關(guān)性分析，探討六味骨痹湯對OA滑膜組織的影響及其與軟骨修復(fù)的相關(guān)性。

1.7 統(tǒng)計方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用隨機區(qū)組設(shè)計的單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。組織病理學(xué)評分采用Kruskal-Wallis法檢驗，組間比較以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，各組間兩兩比較以P＜0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。連續(xù)變量用Pearson法行相關(guān)性分析，取相關(guān)系數(shù)r＞0為正相關(guān)，r＜0為負相關(guān)，取｜r｜≥0.6為強相關(guān)，｜r｜＜0.2為無相關(guān)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物一般情況 全部實驗兔OA模型造模均成功，實驗過程無脫失，均行結(jié)果分析。灌胃期間硫酸氨基葡萄糖組有1只實驗兔出現(xiàn)腹瀉，予土霉素治療2 d后癥狀消失。其余動物除關(guān)節(jié)腫脹及跛行等骨關(guān)節(jié)炎癥狀外，未出現(xiàn)其他不良情況。

2.2 六味骨痹湯對滑膜及軟骨組織形態(tài)學(xué)、軟骨Ⅱ型膠原蛋白表達的影響

2.2.1 滑膜組織形態(tài)學(xué)變化 正常組滑膜組織細胞、纖維組織排列整齊，未見明顯組織增生，見圖1-a；模型組見大量排列紊亂的炎性細胞，纖維組織增生，周邊可見較多毛細血管增生，見圖1-b；六味骨痹湯組有少量炎性細胞浸潤，有滑膜細胞及纖維組織增生，排列較模型組整齊，滑膜組織周邊毛細血管增生較少，見圖1-c；硫酸氨基葡萄糖組滑膜組織表現(xiàn)與六味骨痹湯組相似，但炎性細胞浸潤較后者明顯，見圖1-d。

圖1 滑膜組織形態(tài)學(xué)變化（HE，×100）Figure 1 Comparison of the morphological changes of synovial tissues in various groups（by HE staining，×100）

2.2.2 軟骨組織形態(tài)學(xué)變化及Ⅱ型膠原蛋白表達 正常組軟骨的4層結(jié)構(gòu)分辨清晰，細胞為卵圓形，排列均勻且整齊，細胞呈卵圓形，軟骨區(qū)染色均勻，顯色好，潮線完整平滑，見圖2-a；模型組軟骨可見不規(guī)則裂隙達輻射層，軟骨細胞形態(tài)改變，數(shù)目減少，排列不均呈簇狀分布，有較多炎癥細胞浸潤，染色不均勻，局部基質(zhì)失染甚至無染色，潮線不清晰或多重潮線，見圖2-b；六味骨痹湯組關(guān)節(jié)軟骨退變的表現(xiàn)較輕，軟骨裂隙層較淺，軟骨細胞較模型組增多，染色較均勻，潮線基本完整，見圖2-c；硫酸氨基葡萄糖組軟骨表現(xiàn)與六味骨痹湯組相似，見圖2-d。軟骨Ⅱ型膠原蛋白表達的免疫組化結(jié)果見圖3。

2.2.3 滑膜炎癥及軟骨損傷程度評分 與正常組比較，模型組滑膜Krenn評分、軟骨改良Mankin’s評分明顯上升（P＜0.01），Ⅱ型膠原表達評分均明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，六味骨痹湯組、硫酸氨基葡萄糖組滑膜Krenn評分、軟骨改良Mankin’s評分顯著下降（P＜0.01），Ⅱ型膠原表達評分較模型組明顯上升（P＜0.05）；而2個給藥組組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。說明六味骨痹湯可有效緩解兔OA模型滑膜炎癥、修復(fù)軟骨損傷并提高關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原蛋白表達，與硫酸氨基葡萄糖療效相當(dāng)。

圖2 軟骨組織形態(tài)學(xué)變化（HE，×100）Figure 2 Comparison of the morphological changes of articular cartilage tissues in various groups（by HE staining，×100）

圖3 軟骨II型膠原蛋白表達（免疫組化，×100）Figure 3 Comparison of the expression of type II collagen protein in articular cartilage of various groups（by immunohistochemistry，×100）

表1 各組滑膜炎癥及軟骨損傷程度評分比較Table 1 Comparison of the scores for degrees of synovitis and cartilage injury in various groups （±s，s/分）

①P＜0.05，②P＜0.01，與正常組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與模型組比較

組別正常組模型組六味骨痹湯組硫酸氨基葡萄糖組N8 8 8 8滑膜細胞增殖評分0.04±0.16 2.36±1.12 0.73±0.32 0.98±0.45血管增生程度評分0.03±0.49 2.08±0.54 1.34±0.58 1.59±0.87炎性細胞浸潤評分0.05±0.30 2.73±0.49 1.21±0.28 1.41±0.40 F PⅡ型膠原表達評分5.41±0.65 0.95±0.68①3.94±1.76③3.79±1.62③27.771＜0.01 Krenn評分0.18±0.10 6.82±1.29②3.01±0.94④3.63±0.79④74.285＜0.01 Mankin’s評分0.59±0.23 7.84±0.54②5.60±0.84④5.78±0.61④76.036＜0.01

2.3 六味骨痹湯對關(guān)節(jié)液TNF-α、IL-1β、MMP-13含量的影響 模型組關(guān)節(jié)液中TNF-α、IL-1β、MMP-13的含量較正常組均明顯上升（P＜0.01），六味骨痹湯組及硫酸氨基葡萄糖組上述指標均較模型組顯著下降（P＜0.01），而2個給藥組組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。說明六味骨痹湯可有效降低兔OA模型關(guān)節(jié)液中TNF-α、IL-1β、MMP-13的含量，且與硫酸氨荃葡萄糖療效相當(dāng)。

表2 各組關(guān)節(jié)液TNF-α、IL-1β、MMP-13含量比較Table 2 Comparison of the contents of TNF-α，IL-1β，and MMP-13 in synovial fluid of various groups[±s，ρ/（μg·L-1）]

表2 各組關(guān)節(jié)液TNF-α、IL-1β、MMP-13含量比較Table 2 Comparison of the contents of TNF-α，IL-1β，and MMP-13 in synovial fluid of various groups[±s，ρ/（μg·L-1）]

①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.01，與模型組比較

組別正常組模型組六味骨痹湯組硫酸氨基葡萄糖組N 8 8 8 8 F P MMP-13 6.63±0.44 10.98±0.87①7.74±0.61②7.73±0.70②62.414＜0.001 TNF-α 215.23±19.08 341.15±19.19①267.13±23.98②266.71±22.34②47.563＜0.001 IL-1β 206.21±17.84 327.86±5.29①193.65±4.32②191.47±5.65②348.041＜0.001

2.4 滑膜炎與軟骨損傷的相關(guān)性 利用統(tǒng)計學(xué)軟件進行相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)，各組實驗兔OA模型滑膜炎Krenn評分與軟骨損傷Mankin’s評分呈正相關(guān)，且相關(guān)性較強（r＞0.6，P＜0.05）；滑膜炎Krenn評分與Ⅱ型膠原蛋白表達評分呈負相關(guān)，且相關(guān)性較強（r＜-0.6，P＜0.05），見表3。由此可知，六味骨痹湯對兔OA模型滑膜炎有緩解作用，且滑膜炎的緩解與軟骨的修復(fù)呈較強的正相關(guān)。

表3 滑膜炎Krenn評分與軟骨Mankin’s評分、Ⅱ型膠原表達評分的相關(guān)性Table 3 The correlation between synovitis Krenn score and cartilage Mankin’s score，and type II collagen expression score

3 討論

OA的發(fā)生發(fā)展涉及多種因素的參與，它的基本病理變化為關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨的損傷及關(guān)節(jié)內(nèi)其他組織的炎性病變。近年來不少研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制關(guān)節(jié)滑膜炎癥可有效緩解OA臨床表現(xiàn)，且滑膜炎癥和其相關(guān)因子與關(guān)節(jié)軟骨的損傷息息相關(guān)。

滑膜組織通過產(chǎn)生滑液不僅可以潤滑關(guān)節(jié)，還能為軟骨提供營養(yǎng)物質(zhì)，促進Ⅱ型膠原蛋白的表達。研究發(fā)現(xiàn)滑膜組織可吞噬關(guān)節(jié)內(nèi)的異物從而避免關(guān)節(jié)軟骨受到磨損[6]，而一旦因各種原因?qū)е禄ぎa(chǎn)生炎癥，滑膜炎癥在OA進程中則會進一步造成軟骨退變并且誘發(fā)疼痛及活動不利、交鎖等關(guān)節(jié)功能障礙：其關(guān)鍵病理部位在關(guān)節(jié)滑膜—軟骨交界，炎性滑膜纖維細胞增殖導(dǎo)致周圍血管通透性下降，從而使軟骨細胞缺乏滑液的滋養(yǎng)而萎縮，而炎性滑膜所分泌的炎癥介質(zhì)和細胞因子則會加速這種破壞[6]；此時炎性滑膜的吞噬作用下降，對附著在其表面或裹入其中的異物和軟骨碎片無法產(chǎn)生降解作用，滑膜進一步增生肥大，嵌夾在關(guān)節(jié)間則造成關(guān)節(jié)的交鎖[7]。由此可見，關(guān)節(jié)滑膜炎不僅是OA的伴隨癥狀，也是導(dǎo)致OA發(fā)生的重要因素，可對關(guān)節(jié)的力學(xué)結(jié)構(gòu)及功能造成破壞，特別是在OA早期，滑膜炎癥要比軟骨損傷更容易被發(fā)現(xiàn)。在治療OA的過程中，滑膜炎癥可通過實驗室檢查、彩超等影像學(xué)檢查進行評估，而對軟骨損傷的修復(fù)程度目前臨床缺乏有效手段進行觀察[8]。通過抑制滑膜炎癥對OA關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)及臨床癥狀改善起著至關(guān)重要的作用，且此方法在臨床的開展和療效觀察方面都具有較好的可行性。

現(xiàn)有文獻報道的由滑膜炎分泌且對軟骨損傷的炎性因子主要包括白細胞介素（IL）、腫瘤壞死因子（TNF）及基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等。IL-1β在OA關(guān)節(jié)滑膜細胞中表達上調(diào)，直接參與滑膜炎癥的過程，促進OA的發(fā)展[9]；TNF-α是一種促炎癥細胞因子，它可較強地促進組織分解代謝、發(fā)熱、白細胞趨化及組織的多種炎癥遞質(zhì)分泌。研究發(fā)現(xiàn)TNF-α水平與膝骨關(guān)節(jié)炎嚴重性指數(shù)呈正比，而IL-1β和TNF-α不僅直接參與了軟骨的破壞，還促使滑膜組織分泌MMPs，例如它們可提高MMP-13的基因表達，特異性降解Ⅱ型膠原纖維，從而破壞軟骨結(jié)構(gòu)[8]。IL-1β和TNF-α主要由滑膜細胞、單核細胞和軟骨細胞分泌，將它們作為OA治療的靶點非常有意義。西醫(yī)治療OA滑膜炎的藥物主要包括非甾體抗炎藥（NSAIDs）和硫酸軟骨素。二者均可直接緩解急慢性滑膜炎癥癥狀，且后者可作用于軟骨細胞，對軟骨損傷有一定的修復(fù)作用，臨床治療OA滑膜炎療效良好；但它們治療滑膜炎多見胃腸道不適等不良反應(yīng)，從而限制了部分患者的應(yīng)用。

OA屬中醫(yī)學(xué)“痹癥”范疇，關(guān)節(jié)滑膜、軟骨及軟骨下骨屬于中醫(yī)學(xué)中的“筋”、“骨”。《黃帝內(nèi)經(jīng)》《張氏醫(yī)通》中提到：“肝主筋；腎主骨”，“膝為筋之府，膝痛無有不因肝腎虛者；骨痹者傷于腎”。故各種原因?qū)е碌母文I虧虛會引起本病，腎虛則不能養(yǎng)骨，肝虧則不能榮筋，導(dǎo)致關(guān)節(jié)失利；OA在西醫(yī)中則表現(xiàn)為滑膜的炎癥及軟骨的損傷[6]。“六味骨痹湯”中君藥淫羊藿溫腎壯陽、強筋骨、祛風(fēng)濕；臣藥南五加皮、龜甲可增強其補腎強骨、祛風(fēng)濕之效，且龜甲滋腎陰，可防止藥性過于溫燥；佐藥懷牛膝、骨碎補除有補腎強骨之功，尚有活血通經(jīng)之效，懷牛膝還可引藥下行，使諸藥之功抵達骨節(jié)；生甘草可緩急止痛，調(diào)和諸藥，且其清熱之效可避免全方過于溫燥。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，方中的淫羊藿苷可降低小鼠OA模型MMP-13及TNF-α的mRNA表達，緩解滑膜炎癥及軟骨損傷[10]；五加皮的有效成分五加皮正丁醇可提高小鼠足腫脹模型的痛閾值，起到抗炎鎮(zhèn)痛的作用[11]；骨碎補的有效成分總黃酮能夠減輕兔膝OA模型的滑膜炎癥和軟骨退行性變[12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，牛膝總皂苷能有效減輕兔OA模型滑膜病變的嚴重程度，改善關(guān)節(jié)粘連度[13]，還可提高實驗兔關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原蛋白表達，降低關(guān)節(jié)液中MMP-3、IL-1β及TNF-α的含量，促進軟骨修復(fù)[14]；并且發(fā)現(xiàn)六味骨痹湯可降低兔OA模型關(guān)節(jié)軟骨Pelletier及改良Mankin’s評分，對關(guān)節(jié)軟骨有一定的修復(fù)作用[2]。

本研究結(jié)果顯示，六味骨痹湯可有效降低兔OA模型關(guān)節(jié)液中TNF-α、IL-1β及MMP-13的含量，減輕骨關(guān)節(jié)炎滑膜炎癥，同時，滑膜炎癥的緩解程度與軟骨的修復(fù)及Ⅱ型膠原蛋白表達的改善程度呈較強的正相關(guān)，證實了緩解滑膜炎癥對軟骨損傷修復(fù)及OA癥狀緩解的有效性，這為治療OA多途徑研究和治療提供了新思路，也為中醫(yī)采用補肝腎、強筋骨法治療OA提供了科學(xué)依據(jù)。