莞香靈芝與市售靈芝中總三萜含量的對比分析

戚怡， 呂思敏， 丁鴻燕， 李林科， 吳鐵，， 于豐彥

（1.廣東醫科大學，廣東東莞 523808；2.廣東醫科大學﹠廣東潤和生物科技有限公司輔酶Q10聯合研究中心，廣東東莞 523808）

靈芝藥用在我國已有2 000多年的歷史，其藥用及保健價值一直備受青睞，銷量快速增長，但由于野生靈芝資源稀缺，所以對人工栽培靈芝的需求越來越大。“莞香靈芝”是以瑞香科沉香屬植物沉香的木屑為栽培原料培養出的一種以靈芝總三萜含量較高為特色的靈芝新品種（專利申請號：201610320833.5）。靈芝總三萜是在靈芝中發現的一類三萜類化合物，是靈芝的主要化學和藥效成分，具有抗腫瘤、保肝護肝、降低膽固醇、降血脂、降血糖、抗氧化延緩衰老、抗HIV等功效[1-3]。

為更好地開發和推廣莞香靈芝，本研究分別采用2015版《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》）及《安徽省地方標準》中的方法檢測靈芝總三萜的含量，對7種隨機市售的靈芝及人工栽培的莞香靈芝進行對照檢測與評價。《中國藥典》、《安徽省地方標準》均以紫外分光光度法測定總三萜，以香草醛—冰乙酸顯色，區別在于二者提取方法不同，但均有對應的質量評估標準，現將研究結果報道如下。

1 材料

1.1 儀器 FR223CN電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；紫外—可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；水浴鍋（上海愛明儀器有限公司）；超聲波清理器（上海科導超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥與試劑 樣品G1～G7（見表1）為隨機市售不同來源地的靈芝子實體，均購自廣東化州市不同藥材批發部；樣品G8為實驗室用莞香木栽培的靈芝子實體（莞香靈芝，專利申請號：201610320833.5）。齊墩果酸對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：821882）；無水乙醇、氯仿、高氯酸均為分析純；5%香草醛—冰乙酸（現配現用）。

1.3 統計方法 采用SPSS 23.0軟件進行數據分析，計量資料以均值±標準差(±s)表示，樣品含量比較采用方差分析，莞香靈芝（G8）與市售靈芝（G1～G7）總三萜含量比較采用LSD法。

表1 市售靈芝來源信息Table 1 The information of commercial Ganoderma scorces

2 方法與結果

2.1 按《中國藥典》標準檢測靈芝總三萜含量

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取齊墩果酸5mg，用甲醇溶解，超聲1 min促溶，用甲醇定容至25 mL量瓶中，4℃冰箱保存，作為對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 每種試藥分別取粉碎的靈芝子實體試樣平行2份，精密稱取樣品各2 g，置于100 mL錐形瓶中，加入50 mL的無水乙醇溶液，超聲處理（功率40%、頻率53 kHz）45 min；抽濾，濾液置于100 mL容量瓶中，用適量的無水乙醇溶液洗滌容量瓶和濾渣，洗液并入同一容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 標準曲線的繪制 精密量取上述對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別置于10 mL的EP管中，80～90℃水浴揮干，放冷；加入新配制的香草醛—冰醋酸溶液（精密稱取香草醛5 g加入10 mL的冰醋酸，并使它溶解）0.2 mL，高氯酸0.8 mL，搖勻。在70℃水浴中加熱15 min；立即水浴中冷卻5 min，取出，精密加入乙酸乙酯4 mL，搖勻，以相應試劑為空白，在546 nm處測定吸光度[D（λ）]，以齊墩果酸含量（m/mg）為橫坐標X，吸光度D（546 nm）為縱坐標Y，繪制標準曲線。求得回歸方程為Y=8.530X-0.038，R2=0.997。靈芝總三萜線性范圍為0.02～0.10 mg。標準曲線見圖1。

圖1 按《中國藥典》標準繪制的齊墩果酸標準曲線Figure 1 Standard curve of oleanolic acid drawn following Chinese Pharmacopoeia standard

2.1.4 樣品的含量測定 取供試品適量，置于10mL的EP管中80～90℃水浴揮干，放冷；加入新配制的香草—醛冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，搖勻，在70℃水浴中加熱15 min，立即水浴中冷卻5 min；取出，精密加入乙酸乙酯4 mL，搖勻。以相應試劑為空白，在546 nm處測定吸光度[D（λ）]，平行2份，取平均吸光度D（546 nm）。通過線性回歸方程算得測定用的樣液中三萜類物質的質量。按公式計算各樣品總三萜含量（w）：w（g/100 g）=（m2×V1）/（m1×V2×1 000）×100。其中：m2為回歸方程計算出的含量；m1為試樣的質量；V1定容體積；V2使用樣液的體積。結果見表2。

表2 莞香靈芝與市售靈芝總三萜含量測定結果（按《中國藥典》標準測定）Table 2 The determination results for the contents of total triterpenoids in Guanxiang Ganoderma and commercial Ganoderma according to Chinese Pharmacopoeia standard

2.2 按安徽省地方標準檢測靈芝總三萜含量

2.2.1 對照品溶液的制備 齊墩果酸儲備液（0.1 mg/mL）：精密稱取95℃干燥2 h的對照品10.0 mg用無水乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶，作為標準品儲備液（4℃保存）。

2.2.2 供試品溶液的制備 每種試藥分別取粉碎的靈芝子實體試樣1份，精密稱取樣品各1 g，準確至0.1 mg。置于100 mL圓底燒瓶中，加入30 mL氯仿。（60±1）℃水浴回流2 h，減壓過濾，濾渣加入30 mL氯仿，再回流1 h，常壓過濾。合并濾液，40℃旋蒸至干。加入無水乙醇約40 mL，70℃水浴加熱，并搖動至其完全溶解。冷卻至室溫后用無水乙醇定容至50 mL，等待測液。

2.2.3 標準曲線的繪制 取標準品儲備液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL置于10 mL EP管中，常壓水浴蒸干溶劑（98～100℃）。加入新配制的5%香草醛—冰乙酸溶液0.20 mL和高氯酸0.80 mL，搖勻。70℃水浴加熱15 min，取出，冰水冷卻5 min，用自來水浴調至室溫。用移液管準確移取冰乙酸5.00 mL稀釋，搖勻。以試劑空白做參照，在30 min內用紫外可見分光光度計在545 nm處測吸光度[D（λ）]值。以吸光度D（545 nm）為縱坐標Y，以三萜含量（m/mg）為橫坐標X，繪制標準曲線，求出直線回歸方程并計算相關系數。求得回歸方程為Y=8.288X-0.040，R2=0.996。靈芝總三萜線性范圍為0.01～0.12 mg。標準曲線見圖2。

圖2 按安徽省地方標準繪制的齊墩果酸標準曲線Figure 2 Standard curve of oleanolic acid drawn following Anhui local standard

2.2.4 樣品的含量測定 吸取待測液適量于25 mL具塞比色管中，常壓水浴蒸干溶劑（98～100℃）。加入新配制的5%香草醛—冰乙酸溶液0.20 mL和高氯酸0.80 mL，搖勻。70℃水浴加熱15 min，取出，冰水冷卻5 min，用自來水浴調至室溫。加冰乙酸5.00 mL稀釋，搖勻。以試劑空白做參照，在30 min內用紫外可見分光光度計在545 nm處測吸光度[D（λ）]值。通過線性回歸方程算得測定用的樣液中三萜類物質的質量。按下面公式計算各樣品靈芝總三萜含量（w）：w（g/100 g）=[m2/m1（1-w′）×（V2/V1）×1 000]×100。其中：m1為試樣的質量，單位為g；m2為通過線性回歸方程算得的測定用樣液中三萜類物質的質量，單位為mg；V1為待測液定容的體積，單位為mL；V2為測定用的樣液體積，單位為mL；w′為試樣的含水量，單位為克每百克（g/100 g）。結果見表3。

表3 莞香靈芝與市售靈芝總三萜含量測定結果（按安徽地方標準測定）Table 3 The determination results for the contents of total triterpenoids in Guanxiang Ganoderma and commercial Ganoderma according to Anhui local standard

2.3 《中國藥典》方法檢測莞香靈芝與市售靈芝總三萜含量的差異性對比 由表4～6可看出，8種靈芝含量之間存在顯著性差異（P＜0.05），莞香靈芝平均含量顯著高于其他7種市售靈芝平均含量（P＜0.05），G1的平均含量顯著低于其他種靈芝的平均含量（P＜0.05）。

3 討論

靈芝為食藥兩用真菌，我國已將靈芝列入《中國藥典》范圍之內，并可根據靈芝的實體中的主要活性成分和營養成分高低對其進行全面的功能評價[4]。靈芝中所含靈芝三萜具有顯著的藥理活性，《中國藥典》及地方標準中均以檢測總三萜成分作為評價靈芝質量中必不可少的重要指標之一。安徽省是我國最重要的靈芝產區，其中宣城旌德縣及大別山是有名的靈芝培植基地，安徽省地方標準（DB34/T 485—2004）中建立的大別山靈芝的標準是國內較早制定的地方標準，有重要行業代表的參考意義，其有機溶劑回流提取主要是運用總三萜溶于一些有機溶劑，使得總三萜裝入到溶劑中而除去不溶性的雜質。而《中國藥典》要求試品經過超聲波提取，利用超聲波產生強烈震蕩、高速和在溶劑和樣品之間產生聲波空化作用，導致溶液內氣泡的形成、增長和爆破壓縮，破壞植物藥材的細胞，使溶劑能夠滲透到藥材細胞中，提高目標物從固相轉移到液相的傳質速率。本研究采用上述2種方法，以齊墩果酸為對照品，用紫外—可見分光光度法，對靈芝總三萜含量進行測定，測得莞香靈芝及市售靈芝中靈芝總三萜含量。按照《中國藥典》方法檢測，靈芝總三萜不得少于0.50%，本研究測得長白山、廣西、江西產靈芝，莞香靈芝均符合要求，莞香靈芝和市售靈芝（分別產自安徽、山東、河南、長白山、廣西、廣東、江西等地）等8種靈芝含量之間存在顯著性差異（P＜0.05），莞香靈芝平均含量顯著高于其他7種市售靈芝平均含量（P＜0.05），安徽產靈芝子實體的平均含量顯著低于其他種靈芝的平均含量（P＜0.05）。按照安徽省地方標準方法檢測：靈芝總三萜含量（w/%）≥1.2，本研究測得僅有莞香靈芝符合要求。本研究結果表明，莞香靈芝的靈芝總三萜含量明顯高于市售其他品種的靈芝，并符合中國藥典及地方標準的要求。提示以莞香木為原料栽培的靈芝可能具有更好的藥理功效，在食用、保健及藥用研發時可以優先選擇總三萜含量更高的莞香靈芝。

表4 莞香靈芝與市售靈芝總三萜的含量Table 4 Comparison of Guanxiang Ganoderma and commercial Ganoderma (±s)

表4 莞香靈芝與市售靈芝總三萜的含量Table 4 Comparison of Guanxiang Ganoderma and commercial Ganoderma (±s)

編號G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8份2 2 2 2 2 2 2 2靈芝總三萜含量（w/%）0.354±0.049 0.455±0.031 0.370±0.030 0.600±0.008 0.727±0.006 0.370±0.022 0.523±0.070 0.937±0.091

表5 8種靈芝平均含量的差異性分析Table 5 Differentiation among average contents in 8 kinds of Ganoderma

表6 莞香靈芝與市售靈芝總三萜含量對比Table 6 Comparison of contents of total triterpenoids in Guanxiang Ganoderma and commercial Ganoderma

很多研究[5-7]表明，不同栽培條件、不同栽培方式、不同處理下培養的靈芝在重要成分的含量方面存在顯著差異。莞香，為瑞香科沉香屬木，是在我國樹木中唯一以“東莞”命名的樹木，歷來是東莞的特產，其老莖受傷后所積得的樹脂，俗稱沉香，可作香料原料，亦為治胃癌特效藥。為了得到更多的沉香，每年莞香農都要對莞香木進行鑿采，剔除下來的白木香下腳料可充分利用為莞香靈芝栽培原料。利用莞香木屑為原料培植出的靈芝中總三萜含量較高，這可能與培養基質中的莞香木的養分及活性成分遷移有關。

本研究測得莞香靈芝中總三萜含量明顯高于市售的不同品種靈芝，符合《中國藥典》及地方標準的要求，為莞香靈芝的開發與利用提供了有意義的科學依據。