水-肥耦合對新銀合歡幼苗抗氧化酶活性及肥力利用能力的影響

徐建霞，王建柱

(1.三峽大學 三峽地區生態保護與治理湖北省國際聯合研究中心，湖北 宜昌 443002；2貴州省農業科學院旱糧研究所，貴州 貴陽 550006)

【研究意義】干旱是影響植物生長發育的逆境因子，對作物造成的損失僅次于病蟲害危害[1]。氮和磷是合成蛋白質、核苷酸、磷脂和植物體內某些生長素的主要元素，與植物的生理代謝活動密切相關，在植物細胞的分裂分化、發育生殖及各器官的分化發育過程中發揮重要作用，是影響植物生長的重要營養因子[2]。當氮和磷元素成為植物生長發育的限制元素時，會影響植物的生長與光合[3]、葉片形態變化[4]、根系統形態及結構變化[5]、地上地下生物量分配及植物功能群落組成[6]、根的形成和壽命[7]。新銀合歡(Leucaenaleucocephala)適生性強，主根極發達，為豆科(Leguminosae)銀合歡屬(Leucaena)的多年生常綠喬木，是三峽地區及我國西南山區理想的水土保持和木本綠肥作物，探討不同水肥水平對新銀合歡幼苗抗氧化酶活性及肥力利用能力的影響，對新銀合歡幼苗栽培及管理具有重要意義。【前人研究進展】在水分不足的干旱或半干旱地區施用肥料是否有利于植物或農作物的生長發育一直是一個有爭議的問題[8]。Li[9]等研究認為，在土壤水分有限的條件下，施用某些肥料有利于緩解或消除植物營養虧缺對生長發育產生的不利影響。劉鎖云[10]的研究也認為，在相當寬裕水勢范圍內適當增施肥料能提高作物對干旱的忍受能力，且隨著施肥濃度的加大，土壤肥力增加，作物能增加對養分的吸收，從而提高旱地作物產量。Xue[11]等研究發現，施用肥料能促進作物根系生長發育，使之在干旱條件下能加速生長并從土壤深層探尋和吸收水分，從而提高作物對水分的利用效率，提高產量。但也有學者認為，在土壤極度干旱的情況下，施肥對作物無效，在輕度干旱的條件下，施肥則有利于提高作物生長和產量[12]。呂麗華[13]等研究水肥互作對冬小麥及夏玉米的生長影響，結果發現限水條件下土壤水是限制氮肥肥效發揮的主要因素，通過改善土壤水分條件可更有效提高氮肥肥效；閆春娟[14]等對大豆的研究發現，水肥互作對大豆莖稈、莢皮及籽粒產量呈顯著性的影響。而目前關于新銀合歡的研究報道都主要是對單一環境因素(如水分、土壤質地、土壤養分)的響應[15-17]，然而關于水分和施肥對新銀合歡幼苗的聯合影響尚不清楚。【本研究切入點】目前，針對不同水肥條件下抗氧化酶活性和肥力利用能力影響的研究主要集中在農作物和經濟作物上，尚無水肥互作對新銀合歡幼苗抗氧化酶活性及肥力利用效率的報道?！緮M解決的關鍵問題】本文以三峽庫區邊坡消落帶土壤為基土，采用室內控制法研究新銀合歡幼苗在不同水肥條件下的抗氧化酶活性及肥力利用效率，探討新銀合歡苗木的抗旱機理；通過新銀合歡幼苗對施肥量的響應，確定其在受到干旱脅迫時的施肥最佳值，為邊坡生態修復樹種新銀合歡幼苗前期引種及栽培管理提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗材料為豆科(Leguminosae)銀合歡屬(Leucaena)新銀合歡幼苗，由三峽地區生態保護與治理湖北省國際聯合研究中心提供。供試土壤為三峽庫區邊坡消落帶土壤，其基本理化性質：全氮1.041 g/kg，有機質14.82 g/kg，全磷0.896 g/kg，pH 7.3(水土比為1∶2.5)。供試土壤經充分混合，隨機分裝于花盆中。所有花盆均放在同一個溫棚隔間。所施氮肥選用硫酸銨(含N 21 %)，磷肥選用過磷酸鈣(含P2O518 %)。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 將新銀合歡幼苗移栽至內徑25 cm、深30 cm的塑料花盆中，每盆1株。待塑料花盆中的幼苗長高至約16 cm(6月4日)時，開始進行施用水肥試驗。設正常澆水組(土壤含水量約維持在田間持水量的75 %)和干旱脅迫組(試驗前1 d正常澆水，自試驗開始至結束(7月24日)不再澆水(共進行干旱脅迫50 d)；試驗過程中進行施加氮肥干預，設4個施肥梯度處理：不施氮CK(N0)、低氮(N1)、中氮(N2)和高氮(N3)，施氮比例為0∶1∶2∶3，其中，N1為0.86 g/株。每處理重復6株，隨機區組排列。各氮肥干預處理所施磷肥量相同，均為0.3 g/株。各肥料施用量見表1。

1.2.2 測定指標及方法 葉片取樣及抗旱性相關指標測定：葉片取樣和抗旱性相關指標測定參照李合生[18]方法。其中，葉片電導率采用電解質滲量法測定；葉綠素含量采用丙酮浸提法測定；可溶性糖含量采用蒽酮法測定；游離氨基酸含量采用茚三酮溶液顯色法測定；SOD活性采用氮藍四唑(NBT)法測定；POD活性采用愈創木酚法測定；CAT活性采用紫外吸收法測定；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸比色法測定。

新銀合歡幼苗生長勢和生物量的測定：幼苗株高等指標采用米尺進行測量，并觀察記錄植株葉片生長狀況和分枝等形態生長特征。幼苗生物量于7月24日試驗結束時測定：將各盆植株與土壤分開后洗凈根、莖和葉上的土壤，晾干，分類存放。根和莖剪切成小塊后與葉各自分開置于烘箱中先于105 ℃殺青處理15 min，后置于65 ℃烘箱烘干24 h至恒重，取出冷卻至室溫后在分析天平(精確度為0.0001)上稱其干重，三者重量之和即為新銀合歡幼苗的總生物量。

表1 新銀合歡幼苗不同施肥方案(g/株)

新銀合歡幼苗根、莖、葉各部分氮磷含量測定：植物氮、磷含量采用濃H2SO4-H2O2法消煮后，參照楊貴明[19]的方法進行測定；土壤氮、磷含量采用濃H2SO4-HCOl4法消煮后均采用連續流動分析儀進行測定。

相關參數的計算：氮(磷)運轉效率(%)=葉片中氮(磷)積累量/整個植株(根、莖、葉)積累量×100；氮素肥料當年利用率(%)= [施氮處理整個植株(根、莖、葉)中氮素累積量-無氮處理整個植株(根、莖、葉)中氮素累積量]/氮素肥料施用量×100 %。

1.3 統計分析

試驗數據采用Excel 2007進行整理，以SPSS 19.0進行統計分析，以LSD進行差異顯著性檢驗和多重比較，以Origin 8.1和Excel 2007制圖。

2 結果與分析

2.1 不同處理植株幼苗生物量含量的變化

正常澆水時N1、N2和N3處理的單株總生物量和各營養器官生物量均顯著高于CK(N0)(P<0.05，下同)，N1、N2和N3處理間也存在顯著差異(表2)，根占比重以CK(N0)最高，N2處理最低；莖和葉占比重以N2處理最高。干旱脅迫時，N2和N3處理的單株總生物量及各營養器官生物量均顯著高于CK(N0)和N1處理，而N1處理與CK(N0)無顯著差異(P>0.05，下同)；根占比重以CK(N0)最高，隨施氮量的增加，根占比重呈下降趨勢；莖占比重以N2處理最高，葉占比重則以N1處理最高。隨施氮量的增加，干旱脅迫和正常澆水條件下新銀合歡幼苗生物量積累量的差值在減少，即干旱脅迫組N1處理幼苗的生物量減少量(1.09 g)大于N2處理(0.53 g)。

表2 不同土壤水分和施肥條件對新銀合歡幼苗生物量及其分配的影響

注：同一水分條件同列數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: The different lowercase letters on the same water condition represent significant difference (P<0.05).

2.2 不同處理對新銀合歡幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

2.2.1 對超氧化物歧化酶(SOD) 活性的影響 葉片是植物光合作用的主要器官，也是對環境變化最為敏感的器官之一，葉片中的酶活性是植物對環境的適應或環境變化的最直接響應[20]。超氧化物歧化酶(SOD)是植物體內重要的抗氧化酶，可以清除植物體內自由基并對抗與阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，是植物抗逆生理的重要指示。相同施氮條件下，干旱脅迫組幼苗葉內SOD總活性明顯高于正常澆水組；其中干旱脅迫時N2處理SOD總活性最高，正常澆水CK(N0)處理SOD總活性最低(圖1)。正常澆水時， SOD總活性隨施氮量的增加而增加，CK(N0)處理SOD總活性顯著低于N1、N2和N3處理，表明水分充足條件下增施氮可提高新銀合歡幼苗葉SOD的總活性；干旱脅迫時，CK(N0)處理SOD總活性最低，N2處理最高，而N3處理時SOD總活性有所下降，CK(N0)組SOD總活性與N2、N3之間差異性顯著而與N1不顯著，這表明適宜的氮濃度能顯著提高新銀合歡幼苗葉SOD的總活性，緩解干旱脅迫導致的活性氧或其它過氧化物自由基對幼苗葉細胞膜系統的傷害，延緩葉片衰老。

2.2.2 對過氧化物酶(POD) 活性的影響 植物體中過氧化物酶(POD) 活性與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等均有關，也是植物組織老化的一種生理指標[20]。同一氮肥處理下，干旱脅迫組幼苗POD總活性顯著高于正常澆水組，表明水分對POD活性有顯著影響。干旱脅迫下，POD總活性隨施氮水平升高呈先上升后降低的趨勢，CK(N0)處理顯著低于N2和N3處理；正常澆水時，POD總活性隨施氮水平的升高而升高，N3處理與其它處理組間均存在顯著性差異(圖2)。干旱條件下N2(1.72 g/株)處理葉片POD總活性的升高量(與CK處理的差值73.1 U/gFW·min)高于正常澆水條件下N2處理的升高量(43.8 U/gFW·min)，說明在新銀合歡幼苗受干旱脅迫時，可以通過適量施氮(1.72 g/株)來減輕自由基對葉細胞的傷害，從而減輕干旱脅迫對幼苗葉片的影響(圖2)。

同一處理圖柱上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；下同Different lowercase letters on the same column represented significant difference(P<0.05). The same as below圖1 不同水肥條件下幼苗葉片SOD活性含量變化Fig.1 Changes of SOD activity of seedlings leaves under different water and fertilizer concentrations

圖2 不同水肥條件下幼苗葉片POD活性含量變化Fig.2 Changes of SOD activity of seedlings leaves under different water and fertilizer concentrations

2.2.3 對過氧化氫酶(CAT) 活性的影響 過氧化氫酶(CAT)是一種酶類清除劑，可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內的過氧化氫，從而使細胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關鍵酶之一。相同氮肥處理下，干旱脅迫組幼苗葉CAT總活性明顯高于正常澆水組，說明水分缺失誘導了葉片內CAT的活性增強，在一定程度上減緩了干旱對幼苗葉片的傷害(圖3)。正常澆水時，隨氮素濃度的升高， CAT總活性含量呈上升趨勢，N3與N2處理顯著高于CK(N0)處理，而N3與N2處理間無明顯差異；干旱脅迫下也呈現出相似的結果。水分充足和干旱脅迫下施氮均能提高新銀合歡幼苗葉片CAT的總活性，有利于植物清除H2O2，使膜脂過氧化物維持在較低水平，實現自我保護。

圖3 不同水肥條件下幼苗葉片CAT活性含量變化Fig.3 Changes of CAT activity of seedlings leaves under different water and fertilizer concentrations

表3 不同水分施肥條件下幼苗對氮磷的吸收情況

注：同一水分條件同列數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；NC：含氮量；PC：含磷量。

Note: The different lowercase letters on the same water condition represented significant difference (P<0.05). NC:Nitrogen content; PC:Phosphorus content.

2.3 不同處理下幼苗對氮磷的吸收及轉運

2.3.1 氮累積量 施氮相同時，正常澆水的氮積累量整體高于干旱脅迫組。正常澆水時，N3處理的氮累積量最高，且顯著高于CK(N0)處理，但與N2處理差異不顯著；干旱脅迫時，幼苗中氮累積量隨施氮水平升高呈先增加后降低的趨勢，在N2處理時最高(表3)。正常澆水條件N3處理(1.101 g/kg)、干旱脅迫條件N1(1.097 g/kg)和N3處理(1.203 g/kg)的土壤中氮累積量高于原始土壤氮累積量(1.041 g/kg)，其他處理則均低于原始值。此外，從幼苗植株根、莖、葉氮素累積狀況分析得出正常澆水和干旱處理組幼苗的氮累積量均表現為葉>莖>根的規律，葉的氮素占總氮素的50 %左右。

2.3.2 磷累積量 水氮互作下新銀合歡幼苗中磷素累積量的變化為施氮相同時正常澆水組幼苗中磷積累量高于干旱脅迫組，與氮的總積累量變化趨勢相同(表3)。正常澆水時幼苗體內磷積累量為N3處理最高，干旱脅迫時為N2處理最高；不同處理組的土壤磷積累量均小于原始土壤磷含量(0.896 g/kg)。不同器官的磷累積量在正常澆水和干旱處理下均表現出根>莖>葉的規律，且根累積量顯著較高。

表4 新銀合歡幼苗氮磷運轉效率

2.3.3 幼苗氮、磷運轉效率 不同水分和氮素條件下，氮、磷運轉效率存在一定差異(表4)。正常澆水條件下N3處理氮運轉效率最高為57.65 %，對照組CK(N0)最低為 45.63 %；干旱脅迫條件下氮運轉效率在N2處理時最高為46.37 %，而對照組CK(N0)最低(40.47 %)。磷的轉化效率在正常澆水條件下變化范圍為24.76 %～29.66 %，其中，對照組CK(N0)磷轉化效率最高；在干旱脅迫條件下磷的轉化效率變化范圍為 22.22 %～25.02 %，在N2處理時最高，CK(N0)處理時最低。

2.3.4 幼苗氮素利用率 不同水肥條件下，新銀合歡幼苗氮素利用率存在較大差異。正常澆水時，N1處理氮素當年利用率最高為7.83 %；N3處理最低為6.19 %。干旱脅迫條件下氮素當年利用率在N2處理時最高為5.42 %；N1最低(2.32 %)。從根莖葉各器官的氮素當年利用率情況看，施氮處理后幼苗吸收的氮素都主要用于葉片產量的增加(表5)。

2.4 水肥互作對新銀合歡幼苗各因素的影響

雙因素方差分析表明水分與新銀合歡幼苗總生物量，TN、可溶性糖、SOD、游離脯氨酸含量、丙二醛(MOD)、POD、CAT均存在極顯著的正相關性(P<0.01)，與葉綠素、TP和電導率呈顯著性正相關(P<0.05)。而氮肥的用量除與幼苗TP含量無顯著性相關外(P>0.05)，與其它指標均呈顯著性正相關(P<0.05)。而水分和氮肥的互作效應與所有指標都呈極顯著正相關(P<0.01)，這說明水肥的耦合效應對新銀合歡幼苗在干旱條件下的生長和抗旱具有顯著的作用(表6)。

2.5 不同水肥條件下幼苗各指標之間的相關性分析

由表7可知，生物量除與電導率不相關與MDA顯著負相關(P<0.05)外，與其它指標之間都呈極顯著正相關(P<0.01)；全磷與全氮、葉綠素、游離脯氨酸顯著相關(P<0.05)，而與其他指標不相關(P>0.05)；全氮除與電導率和丙二醛呈顯著負相關外，與其它指標呈極顯著正相關(P<0.01)。SOD、POD、CAT 3種酶呈極顯著正相關(P<0.01)；POD和CAT都分別與MDA呈極顯著負相關(P<0.01)，而SOD與MDA呈顯著負相關(P<0.05)。

表5 新銀合歡幼苗氮素利用率

表6 水肥對幼苗各指標之間的影響

注：*表示顯著水平(P<0.05)；**表示極顯著水平(P<0.01)。TB：總生物量；Chl：葉綠素；TN：全氮；TP：全磷；COND：電導率；SS：可溶性糖；SOD：超氧化物歧化酶；Pro：游離脯氨酸；MDA：丙二醛；POD：過氧化物酶；CAT：過氧化氫酶。下同。

Note: * represented significant difference (P<0.05); **represented extremely significant difference (P<0.01). TB: Total biomass; Chl: Chlorophyll;TN: Total nitrogen; TP: Total phosphorus; COND: Conductivity; SS: Soluble sugar; SOD: Superoxide dismutase; Pro: Free proline; MDA: Malondialdehyde;POD: Peroxidase; CAT: Catalase.The same as below.

表7 新銀合歡幼苗各指標之間的相關性

3 討 論

3.1 水肥互作對抗氧化酶活性的影響

本研究中水分×氮肥的互作效應與SOD、POD、CAT 3種酶都呈極顯著正相關(P<0.01)，說明水氮的耦合效應對新銀合歡幼苗在干旱條件下的生長和抗旱具有顯著的作用；有研究表明，當植物遭受逆境脅迫(干旱、凍害、高溫等)時，單一抗氧化酶或抗氧化劑不能抵御植物在其環境下受到的傷害，許多試驗和研究發現在逆境條件下植物受傷害程度與SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性提升成負相關[22]。本實驗中SOD、POD和CAT活性之間呈顯著正相關，表明3種抗氧化酶起著相互協調的作用。這與楊青川[26]等對扁蓿豆、紫花苜蓿的研究和王小樂[27]等對甘蔗的研究結果一致，說明這些抗氧化酶在新銀合歡幼苗葉內可協同清除葉內多余的活性氧自由基，降低葉細胞滲透性的增加，減少離子大量泄漏及膜脂過氧化，從而保護了葉生物膜的結構和功能，降低或消除干旱脅迫對幼苗葉內細胞造成的傷害[23]。

3.2 水肥互作對幼苗氮磷吸收的影響

土壤中的水分和營養物質是影響植物各階段生長發育和生理代謝的重要影響因子，兩者之間有著密切的聯系，研究表明土壤干旱制約著植物對氮磷等營養元素的吸收利用，而營養元素，特別是氮素不足又會極大的限制水分的作用[28]。本研究發現，施氮量相同時，正常澆水能促進新銀合歡幼苗根系以上各形態指標上升，在干旱脅迫時適當施氮也能促進幼苗生長和總生物量及各器官生物量的提高，這與周利平[29]等的研究結果相同。適量的施氮可以減緩水分脅迫引起的氮代謝紊亂，使缺水植株的蛋白酶、肽酶及核糖核酸酶活性增強，從而維持較高的硝酸還原酶(NR)活性和蛋白質含量[30]，有利于植物根、莖、葉等營養器官的發育和植株群體的協調發展，增強光合作用，因而有利于干物質的生產與積累[31]。本研究中土壤水分和氮肥之間存在明顯的交互效應，當土壤含水量較低時，植物對氮的吸收也相對較低。這主要是由于干旱抑制了植物根系的生長，降低了根系的吸收面積和吸收能力，木質部液流粘滯性增大，從而降低了對營養物質的吸收和運輸[32]。

本研究中施氮顯著提高了新銀合歡幼苗根、莖、葉的氮磷含量，且氮的分配排序為葉>莖>根，磷的排序為根>莖>葉，幼苗的氮養分主要儲存在葉片中，而磷主要儲存在根系中，這與楊貴明[33]等對桑樹的研究結果相一致，也進一步表明葉是新銀合歡幼苗重要的氮養分貯存庫。正常澆水條件下新銀合歡幼苗氮轉運效率隨著施氮量的增加而升高，而氮利用效率的變化趨勢恰好相反。低氮條件下，氮的轉運效率低而利用效率高；原因是低氮條件下少量的氮養分主要貯藏在根系中供根系生長，而向地上部的運輸量減少，這與張耀華[34]等對橡膠苗研究結果一致。高氮條件下，根系吸收氮的同時向地上部運輸量增加[34]，因而氮的轉運效率高而利用效率低。在干旱脅迫條件下，新銀合歡幼苗氮、磷運轉效率及氮素當年利用率均在N2(中氮1.72g/株)水平時最高，而超過此水平后其轉運效率和利用率均下降，原因可能是適宜濃度的施氮提高了土壤水勢和水分的有效性，使一部分原來對植物生長“無效”的水變得“有效”，而水分的有效性又會促進根系對營養物質的吸收和轉移[35]；而過量施用氮肥，反而會加重植物水分脅迫的程度，造成植物體內營養物質的虧損和作物減產[36]。

4 結 論

在水分充足條件下，增施氮肥可提高新銀合歡幼苗的抗氧化酶活性和對氮、磷的吸收能力；干旱脅迫條件下施用中等濃度氮(1.72 g/株)可有效誘導新銀合歡幼苗抗氧化保護酶系統活性增強，從而增強其抗旱性，延緩葉片衰老，同時可顯著增加幼苗對氮磷營養物質的吸收，提高氮素的轉運及利用效率。