苗藥黑骨藤不同極性提取部位急性毒性及抗氧化研究

金文淵 楊欣 劉育辰 劉剛

摘要[目的]對黑骨藤不同極性部位進行急性毒性試驗及抗氧化研究，確定其臨床用藥安全性及活性部位。[方法]急性經口毒性試驗采用SD（180～220g）大鼠，連續灌胃給藥7d（9.75g/kg）后，測定血清中的肝功能和腎功能等相關指標，觀察其肝臟、腎臟毒性反應，采用ABTS（agreementofbasictelecommunicationsservices）法測定肝臟中的總抗氧化能力。[結果]黑骨藤不同極性部位給藥7d后，大鼠未出現死亡，石油醚部位、氯仿部位、醋酸乙酯部位、正丁醇部位組對肝臟和腎臟生化指標均無顯著性影響（P>0.05），水部位組大鼠血清中的ALP和BUN顯著升高（P<0.05）。[結論]黑骨藤的不同極性部位中的石油醚部位、氯仿部位、醋酸乙酯部位、正丁醇部位未出現毒性反應，水部位中的ALP和BUN升高，可能表現出微低毒性。氯仿部位和正丁醇部位表現出較強的抗氧化能力。

關鍵詞黑骨藤;急性毒性;肝損傷;腎損傷;抗氧化能力

中圖分類號R284文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）01-0186-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.055

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

機體要通過一些抗氧化劑防御系統使自由基的產生與消除維持在一個生理性低水平。一旦自由基過多或抗氧化體系出現故障，自由基的產生與消除就會失去平衡，而過多自由基誘導的氧化反應將會引起膜損傷，從而導致核酸代謝產生誤差，進而引發動脈粥樣硬化、癌癥、心腦血管疾病、炎癥、糖尿病等多種疾病。因此通過體外攝入一些抗氧化劑或自由基清除劑來維持機體內自由基代謝的平衡對于預防疾病的發生和人體的健康具有十分重要的意義。目前，中藥中的抗氧化性成分很多，如黃酮類、多酚類、多糖類等，這些都屬于植物類抗氧化性成分。這些抗氧化劑具有較強的還原性，在人體內可以清除人體內不利的自由基，這些抗氧劑可以保護機體免受于這些自由基的損害。近年來，醫藥行業、保健食品行業，越來越關注從中藥中提取分離和純化抗氧化活性成分，這些應用研究為開發植物來源抗氧劑奠定了良好的基礎[1-3]。

黑骨藤藥材資源豐富，具有悠久的臨床應用和食用歷史，生物活性十分廣泛，為貴州常用治療風濕、類風濕疾病及頸肩臂腰腿疼痛的苗藥。目前已開展大量的化學成分和藥理作用研究，并取得了諸多成果。黑骨藤的主要功效活血通經、祛風濕，治跌打損傷、風濕痹疼、口腔炎、咽喉炎、乳腺炎等。但是黑骨藤超量或誤服大量則引起中毒，輕則惡心、嘔吐、暈厥，嚴重時出現心律失常，甚則危及生命。黑骨藤不同極性部位目前缺少其毒性及抗氧化活性的相關資料[4-6]。急性毒性試驗（acutetoxicitytest）是新藥研發和藥物毒理不可以缺少的藥理試驗，對闡明藥物的毒性作用、了解其毒性靶器官具有指導作用。筆者通過SD大鼠經口接受單劑量的黑骨藤不同極性部位混懸液，觀察大鼠在短期內出現的異常反應以及各主要臟器有無異常改變，探討其在生物體內應用的安全性，為進一步研究、開發新藥提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物。SD大鼠，雌性，體重180～220g，由長沙市天勤生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK-（湘）2014-0011。

1.1.2

試劑及藥物配制。藥材采自貴州省貴陽市開陽縣，經貴陽中醫學院藥學院魏升華教授鑒定為蘿藦科杠柳屬黑骨藤（PerplocaforrestiiSchltr.），藥材樣品保存于貴陽中醫學院植物化學實驗室。甘油三酯（TG）、膽固醇（CHO）、總蛋白（TP）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、葡萄糖（GLU）、乳酸脫氫酶（LDH）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）、堿性磷酸酶（ALP）、白蛋白（ALB）試劑盒均購自北京豪邁生物工程有限公司;總抗氧化能力試劑盒（A015-2），南京建成生物科技有限公司，批號20170705。

1.1.3儀器。yc-ro/40純水器（四川怡創科技有限公司）;Varioskanflash酶標儀（ThermofisherScientific）;Allegrax-30rcentrifuge4℃離心機（Beckmancoulter）;Forma8800超低溫冰箱（ThermofisherScientific）;Puzs-300全自動生化儀（北京普朗新技術有限公司）;MettlerToledo電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1供試品制備。黑骨藤藥材陰干，切段，粉碎成粗粉，用8倍量70%乙醇加熱回流提取3次，每次3h，趁熱過濾，合并濾液減壓濃縮至稠膏狀，得醇提物，用適量蒸餾水進行分散，依次用石油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑，得石油醚部位、氯仿部位、醋酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。

1.2.2分組及給藥。雌性SD大鼠42只（180～220g），實驗動物適應環境后隨機分為6組，即空白對照組、石油醚部位組、氯仿部位組、醋酸乙酯部位組、正丁醇部位組、水部位組，每組各7只。灌胃給藥前禁食12h，不禁水。各組給藥劑量按人臨床用量的65倍計算，各組給藥劑量即為9.75g/kg，用0.5%CMC-Na（羧甲基纖維素鈉）配制成濃度為0.4875g/mL的黑骨藤各部位混懸液，空白對照組灌胃等量0.5%CMC-Na。所有大鼠在灌胃給藥后進行常規飼養，自由攝食及飲水，連續給藥7d。各組飼養過程中保持室溫度、濕度等均衡，自由進食飲水[7-8]。

1.2.3試驗取材。試驗取材前大鼠禁食12h，不禁水，次日上午SD大鼠通過腹腔內注射1%戊巴比妥鈉麻醉（5mL/kg體重），迅速打開腹腔，腹主動脈取血，用于生化指標檢測。取出心、肝、脾、肺、腎、腦分別用錫箔紙包好，然后轉移至-80℃冰箱保存備用。每個試驗指標選用同一部位的組織進行。

1.2.4大鼠血清生化指標。SD大鼠腹主動脈取血之后靜置30min，3500r/min離心15min，取1mL上清液置2mL離心管中。采用Puzs-300全自動生化儀檢測血清生化指標，具體指標包括AST、ALP、ALT、BUN、TP、CRE、ALB、GLU、TG、CHO、LDH[9]。

1.2.5總抗氧化能力檢測。準確稱取肝臟組織重量，按重量（g）∶體積（mL）=1∶4的比例，加入4倍體積的生理鹽水或者磷酸緩沖鹽溶液（PBS），冰水浴條件下機械勻漿，以充分破碎細胞并釋放其中的抗氧化物，4℃，12000r/min，離心5min，取上清測定。取10mmol/LTrolox標準液用雙蒸水稀釋成0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mmol/L繪制標準曲線。在405nm采用酶標儀讀取各孔OD（光密度）值[8-9]。

1.3數據統計分析

采用SPSS13.0軟件對試驗數據進行分析，計量數據均以±SD表示，采用單因素方差分析，結果以P<0.05為顯著差異，具有統計學意義。

2結果與分析

2.1黑骨藤不同極性提取部位對大鼠體溫和體重的影響

從表1～2可看出，給藥7d后，黑骨藤有效部位體溫和體重都有增高，與給藥前進行比較，第4天和第6天體重和體溫呈增高趨勢，具有顯著差異（P<0.05）。

2.2血液生化指標檢測結果

2.2.1肝臟功能。試驗結果（表3）顯示，與空白對照組相比，石油醚部位組、氯仿部位組、醋酸乙酯部位組、正丁醇部位組的ALT、AST、ALP無顯著性差異（P>0.05），水部位組中的ALP升高，差異顯著（P<0.05）。蛋白合成主要在肝臟中完成，肝臟不僅能合成自身蛋白，還能分泌90%以上的血漿蛋白質。通過試驗結果分析，黑骨藤不同極性部位中石油醚部位組、氯仿部位組、醋酸乙酯部位組、正丁醇部位組、水部位組與空白組比較，大鼠ALB、TP均屬于正常范圍，沒有發生顯著變化。

2.2.2腎功能。腎臟最主要的功能是維持體液平衡及體內酸堿平衡。腎臟通過腎小球的濾過、腎小管的重吸收及分泌功能，排出體內多余的水分，調節酸堿平衡，維持內環境的穩定。試驗結果（表3）表明，與空白對照組比較，石油醚部位組、氯仿部位組、醋酸乙酯部位組、正丁醇部位組血清中的BUN、CRE無顯著性差異（P>0.05），水部位組血清中的BUN升高，具有顯著差異（P<0.05）。

2.2.3脂類代謝。血液中的膽固醇大多數都能與脂肪酸結合，僅有少數的以游離狀態存在的膽固醇作為細胞膜的成分維持細胞的形態和功能，膽固醇測定對脂肪代謝異常有很大的幫助。試驗結果（表3）顯示，與空白對照組相比，石油醚部位組、氯仿部位組、醋酸乙酯部位組、正丁醇部位組、水部位組的TG無顯著性差異（P>0.05）。

2.2.4糖代謝。由表3可知，與空白對照組相比，氯仿部位組、醋酸乙酯部位組和水部位組的GLU無顯著性差異（P>0.05）;石油醚部位組、正丁醇部位組的GLU明顯降低，具有顯著差異（P<0.01）。

2.2.5能量代謝。乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）分布廣泛，機體組織中幾乎都存在，在糖代謝過程發揮重要作用。試驗結果（表3）顯示，與空白對照組相比，石油醚部位組、氯仿部位組、醋酸乙酯部位組和水部位組的LDH有降低趨勢，但是無顯著性差異（P>0.05）;正丁醇部位組能顯著降低LDH（P<0.05）。

2.3總抗氧化能力

以標準品OD值為橫坐標、各OD值對應的標準品濃度為縱坐標繪制標準曲線，用SPSS得出曲線公式，把樣本測定管測得的OD代入計算公式，求得結果[10]。標準曲線方程為Y=-0.932X+1.2216。與空白對照組比較，石油醚部位組、氯仿部位組、醋酸乙酯部位組、正丁醇部位組和水部位組的TOC明顯升高，具有顯著性差異（P<0.05）。詳見表3。

3結論與討論

動物生長發育情況、營養狀況、生理狀態及健康情況主要由動物外觀、體溫、體重等一般指標可反映，若生長過程中受到毒物、外界環境等因素的影響，可以通過生長發育和外觀反映。該研究采用SD大鼠連續灌胃給藥7d，用藥劑量相當于人臨床用藥65倍，發現黑骨藤有效部位體溫和體重呈增高趨勢，第6天體重和體溫明顯增高，可能由于黑骨藤是溫性中藥，所以體溫和體重增高。血液生化能準確地反映機體的損傷程度，是臨床和試驗研究比較常用的方法，黑骨藤有效部位在TG、AST、ALT、ALP、GLU、BUN等生化指標中存在一定的差異性。AST、ALT、ALP主要存在肝臟中，作為判斷肝臟損傷的經典指標[10-12]。TG主要在肝臟發生代謝反應，可以氧化供能，也可以分泌進入血液，被其他組織利用，當肝臟損傷時，血中TG水平升高。黑骨藤的有效部位水相造成血清ALP升高，使膽汁排泄受到抑制，但血清中的TG未表現出增高趨勢，可能由輕微毒性。綜上所述，黑骨藤水相部分有一定的毒性，但是比較小。服用劑量要適量，不能長時間服用。葡萄糖（GLU）在機體中以碳水化合物的形式被機體直接吸收利用，發生氧化反應，為機體供應活動所需要的能量。黑骨藤有效部位中的石油醚和正丁醇使血清中的GLU顯著降低，可能使糖耐量受損或糖代謝異常導致，不宜長期大劑量服用。

目前，類風濕關節炎給人類健康造成了嚴重威脅，人們逐漸開始重視。類風濕關節炎（rheumatoidarthritis，RA）是一種以關節炎癥和滑膜組織增生為特征的慢性自身免疫性疾病，可引起大量細胞浸潤和炎癥介質的過度產生，最終導致軟骨和骨的破壞，研究表明，黑骨藤具有很好的抗類風濕關節炎作用[13]。機體作為一個整體，存在多種抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶等，主要功能是清除體內產生的各種活性氧，防止產生活性氧誘導的氧化壓力?？偪寡趸芰χ饕煽寡趸蠓肿?、抗氧化小分子和酶的總的水平體現?？寡趸δ茉u價方法主要在體內和體外進行評價。體內抗氧化方法主要采用動物模型，研究證明，人體的抗氧化系統和免疫系統具有相似性，是比較完善和復雜功能的系統，機體抗氧化的能力越強，能有效抵抗外界侵害越強[14-15]。黑骨藤有效部位石油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇、水部位都具有一定的抗氧化能力，有待于進一步進行活性研究，希望能為臨床提供一個抗類風濕關節炎的新藥。

參考文獻

[1]楊玲，許速.氧化應激與疾病發生的相關性[J].西南國防醫藥，2012，22（11）：1268-1270.

[2]SACHIDANANDAMK，FAGANSC，ERGULA.Oxidativestressandcardiovasculardisease：Antioxidantsandunresolvedissues[J].CardiovascDrugRev，2005，23（2）：115-132.

[3]李洋，馬文平，倪志婧.寧夏枸杞體外抗氧化機理研究[J].食品科學，2014，35（1）：79-84.

[4]劉明，劉剛，劉育辰，等.黑骨藤鎮痛抗炎作用活性部位篩選[J].藥物評價研究，2014，37（4）：322-325.

[5]張令令，肖智勇，馬淵，等.苗藥黑骨藤多糖部位HGT-5A的細胞免疫抑制作用及其可能的活性成分[J].中國藥理學與毒理學雜志，2011，25（6）：538-542.

[6]陳芳，汪毅.苗藥黑骨藤的研究及開發應用[J].中國民族民間醫藥，2010，19（1）：6-7.

[7]王秋紅，楊欣，王蒙，等.黃芩與黃柏協同保護黃藥子致肝毒性的實驗研究[J].中國中藥雜志，2016，41（5）：898-903.

[8]曹亮亮，王文曉，張麗，等.基于“有故無殞”思想的醋甘遂毒性研究[J].中國中藥雜志，2015，40（16）：3249-3255.

[9]侯甲福，鄭著家，劉世娟，等.錦花清熱膠囊對動物急性及長期毒性研究[J].毒理學雜志，2016，30（2）：172-173.

[10]趙子婧，鞏政，史少澤，等.補骨脂及其與甘草配伍單次給藥大鼠的毒代動力學及肝腎毒性初探[J].中國中藥雜志，2015，40（11）：2221-2226.

[11]程生輝，張妍妍，李會芳，等.基于黃疸模型大鼠的梔子苷急性肝腎毒性研究[J].中國實驗方劑學雜志，2015，21（4）：174-178.

[12]郭曉，王萌，朱彥，等.中藥腎毒性機制研究現狀及評價方法研究進展[J].中草藥，2015，46（23）：3581-3591.

[13]CHENL，LIJS，KEX，etal.ThetherapeuticeffectsofPeriplocaforrestiiSchltr.StemextractsoncollageninducedarthritisbyinhibitingtheactivationofSrc/NFκBsignalingpathwayinrats[J].JEthnopharmacology，2017，202：12-19.

[14]李維熙，李怡芳，何蓉蓉.兒茶素類化合物抗氧化評價方法及作用機制的研究現狀[J].中藥新藥與臨床藥理，2016，27（2）：295-303.

[15]陳凡，馬善麗，許穎，等.超高壓處理對豆乳總多酚、類黃酮含量及其抗氧化性的影響[J].大豆科學，2011，30（2）：310-313.