干旱脅迫下小麥穎果內源激素的變化及其與胚乳發育的關系

陳昕鈺，陳銘鑫，楊 陽，李 波,2，董召娣，汪巧菊，余徐潤，熊 飛

(1.揚州大學生物科學與技術學院，江蘇揚州 225009； 2.江蘇沿江地區農業科學研究所，江蘇南通 226541)

干旱是小麥生產中常遇到的自然災害之一，它通過影響植株形態結構、生理生化及基因調控，最終影響產量和品質[1]。小麥在營養生長和生殖生長過程中都極易受干旱脅迫的影響，其中開花期和灌漿期干旱對小麥產量的影響最大[2]。胚乳是穎果的主要組織結構，淀粉和蛋白質作為主要儲藏物質，分別以淀粉體和蛋白體的形式積累于胚乳細胞[3]。胚乳細胞的分裂、發育以及其中淀粉和蛋白質的充實度，直接決定小麥的產量和品質[4]。前人觀察了干旱脅迫下小麥穎果組織的結構特征，并研究了干旱對胚乳淀粉和蛋白質積累的影響[5-6]。Singh等[7]研究發現干旱脅迫會降低小麥B-型淀粉粒的比例和直鏈淀粉的含量。Zhang等[8]指出干旱脅迫下小麥穎果中醇溶蛋白和清蛋白含量有所增加。

植物激素是由自身代謝合成的一類有機分子，在植物生長發育和響應逆境脅迫中發揮著重要的調控作用[9]。干旱脅迫下植物內源激素的含量和活性發生改變，從而調控生理生化過程以及同化產物的運輸分配以適應干旱[10]。有研究表明，為響應干旱脅迫，植物中脫落酸(ABA)和細胞分裂素(CTK)含量會發生變化，其中ABA的濃度在植物葉片、花器官和發育的籽粒中均顯著增加[11-12]。張 煒等[13]研究不同激素間的協同調控作用，發現干旱脅迫下小麥幼苗的根、葉片和葉鞘中的ABA、生長素(IAA)的含量均有所增加，二者協同調控氣孔關閉和根系生長。

前人關于干旱脅迫對小麥激素影響的研究較多。Lu等[14]認為干旱條件下抗旱小麥葉片中能積累更多的ABA；Guoth等[15]觀察發現，發生滲透脅迫時干旱敏感型小麥根部的ABA含量較高；Westgate等[16]發現干旱條件下小麥花器官中的ABA含量可增加10～15倍。前人的這些研究主要集中在小麥根、葉以及花器官上，然而有關干旱脅迫下小麥穎果內源激素含量變化的研究鮮有報道，關于干旱脅迫下穎果激素變化與胚乳細胞發育的關系尚不清楚。因此，本研究以小麥品種揚麥16為材料，在幼苗返青至穎果成熟階段進行干旱處理，采集不同發育時期的小麥穎果，采用樹脂切片及顯微觀察等技術，從顯微水平觀察干旱脅迫下小麥胚乳細胞發育的結構特征；同時，采用酶聯免疫吸附法測定激素含量，研究干旱脅迫下小麥穎果內源激素的變化規律及其與胚乳細胞發育的關系，以期為明確干旱誘導激素調控的穎果發育機制及小麥產量和品質提升提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料及處理

試驗于2015年10月至2016年5月在揚州大學江蘇省作物栽培重點實驗室試驗棚內進行。供試小麥品種為揚麥16，由揚州大學農學院提供。采用盆栽方式進行。土壤為砂壤土，基肥含有機質24.5 g·kg-1，速效氮106 mg·kg-1，有機磷33.8 mg·kg-1，速效鉀66.4 mg·kg-1。10月29日播種， 每盆播種20粒，2周后間苗，每盆保留8株。在小麥花期用記號筆標記開花的穎殼并給植株掛牌以確定開花日期，標記的穎花均為穗中部小穗基部的2朵小花。

干旱處理方式為全生育時期干旱，即從幼苗返青期開始到穎果成熟的整個生育階段內嚴格控制澆水量，并采用負壓式水勢計(SP-11,ISSCAS,China)檢測距地表15 cm的土壤水勢，使正常水分組和干旱脅迫組的土壤水勢分別維持在-20 kPa和-60 kPa左右。每處理30盆，整個生育過程中2個處理組的施肥、除草及防蟲害等管理措施均一致。

1.2 穎果千粒重、可溶性糖含量、總淀粉含量以及蛋白質含量的測定

采集成熟小麥籽粒，測定新鮮穎果的千粒重，然后將其置于鼓風干燥箱，105 ℃殺青1 h，42 ℃烘至恒重。將干燥的小麥籽粒研磨成粉末，過100目金屬網篩，備用。稱取200 mg粉末，采用蒽酮比色法[17]測定可溶性糖和總淀粉含量，采用凱氏定氮法[17]測定蛋白質含量。

1.3 穎果組織化學染色及體視顯微鏡觀察

選取不同發育天數的穎果，在體視顯微鏡(MZ6,Leica,Germany)下觀察穎果的形態并拍照。同時，將穎果從中間部位橫切，用I2/KI(0.3% I2+1% KI)染液染色30 s后于體視顯微鏡下拍照。

1.4 穎果組織樹脂切片觀察

采集不同發育時期的穎果，用潔凈的剃須刀片橫向切取穎果中部2 mm厚的片段并迅速置于2.5%戊二醛溶液固定48 h。樣品經磷酸緩沖液漂洗后再經梯度乙醇脫水、環氧丙烷置換、Spurr低黏度樹脂浸透與包埋，70 ℃聚合12 h。將聚合后的樣品用玻璃刀在超薄切片機(Ultracut R,Leica,Germany)上切1 μm的半薄切片，0.5%甲基紫溶液染色，再通過裝有CCD相機的光學顯微鏡(DMLS,Leica,Germany)觀察并拍照。每處理選取3個穎果作為重復，各穎果均來自不同麥穗。

1.5 胚乳及其充實物質數量特征統計

按照Chen等[18]的方法，通過Photoshop軟件(Version CS6,Adobe,USA)處理拍攝的顯微圖像，用Image-Pro Plus圖像分析軟件(Version 6.0,Media Cybernetics,USA)統計胚乳細胞數目、胚乳橫截面積以及胚乳細胞中淀粉體和蛋白體的相對面積。

1.6 穎果內源激素含量測定

采用酶聯免疫吸附法[19]測定小麥穎果中生長素(IAA)、脫落酸(ABA)、赤霉素(GA3、GA4)、玉米素核苷(ZR)和二氫玉米素核苷(DHZR)的含量。

1.7 數據統計與分析

采用Microsoft Excel 2016和 SPSS 19.0軟件統計分析數據，用t測驗進行顯著性分析；采用Photoshop和Origin 9.1軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫下小麥穎果的生長發育

正常水分下，小麥穎果在發育前期形態變化較大，穎果子房不斷縱向膨脹生長，在花后11 d時幾乎達到最大值，在該階段，穎果表面呈乳白色；隨后，穎果橫向加寬生長，表面顏色逐漸變綠；到了花后23～32 d，穎果基本成型，無明顯形態變化，表面顏色逐漸變黃；花后35 d，穎果成熟，脫水變硬。另外，從穎果橫切的I2/KI染色結果可以看出，在花后5 d前，果皮被染成黑色而胚乳組織幾乎未被染色；之后，隨穎果發育，胚乳逐漸被染成黑色并不斷加深，而果皮逐漸變薄，I2/KI染色后的顏色逐漸慢慢消失(圖1A)。說明在穎果發育過程中胚乳淀粉的積累量不斷增加，而果皮淀粉逐漸降解。遭受干旱脅迫后，穎果的形態發育過程與正常水分下基本一致，但干旱會加快穎果的發育進程，促進穎果提前成熟；花后29 d后，穎果發育成熟，成熟時間早于正常水分下發育同時期的穎果；同時，隨著干旱脅迫時間的持續，在發育后期，干旱脅迫下的小麥穎果體積明顯變小，成熟穎果表面皺縮，發育不良(圖1B)。另外，干旱脅迫下穎果橫切的I2/KI染色結果與正常水分處理間無明顯差別。

A:正常水分下小麥穎果形態發育和橫切面I2/KI染色；B:干旱脅迫下小麥穎果形態發育和橫切面I2/KI染色。圖下方的數字為穎果發育天數。

分析成熟小麥穎果千粒重以及可溶性糖、總淀粉和蛋白質含量，發現干旱脅迫下成熟小麥穎果的千粒重為46.69 g，較正常水分處理低20.00%，差異顯著(P<0.05)；同時，其可溶性糖含量和總淀粉含量分別較正常水分處理低35.29%和2.80%，而蛋白質含量較正常水分處理高8.40%，說明干旱脅迫在降低小麥穎果質量的同時還能顯著影響主要儲藏物質(糖類和蛋白)的積累。

2.2 干旱脅迫下胚乳細胞結構的發育

小麥胚乳的發育過程主要包括胚乳細胞的分裂、生長以及胚乳細胞中淀粉和蛋白的充實。在花后5 d，胚乳細胞仍具有分裂能力，細胞核明顯且細胞中已經積累了少量的小淀粉體。干旱脅迫下，小麥胚乳中存在更多的細胞核和淀粉體，細胞分裂旺盛(圖2A和圖2C)，且其胚乳細胞數目以及胚乳面積也顯著多于或高于正常水分處理(圖3A和圖3B)。說明，干旱脅迫能促進穎果發育早期胚乳細胞的分裂和生長。

花后10 d，胚乳淀粉的積累量增多，體積變大，正常水分和干旱脅迫的小麥胚乳細胞中積累了小蛋白體，且兩者的蛋白體相對面積無顯著差異，但遭受干旱脅迫的小麥胚乳細胞中淀粉體的數量較多，淀粉體相對面積顯著大于正常水分處理(圖2B和圖2D；圖3C和圖3D)。另外，干旱脅迫下的小麥胚乳數目和胚乳面積均顯著少于或小于正常水分處理(圖3A和圖3B)，說明，隨干旱時間持續，胚乳細胞的進一步分裂和擴張受到抑制，同時也影響了淀粉的充實。

花后15 d，胚乳細胞的分裂和胚乳細胞化基本完成，細胞數目穩定，穎果灌漿達到高峰，胚乳淀粉進一步充實，并且在胚乳細胞中積累了蛋白體。正常水分和干旱脅迫下小麥的胚乳細胞數目無顯著差異，但干旱脅迫下小麥的胚乳面積顯著小于正常水分處理(圖3A和圖3B)，說明干旱脅迫能阻礙胚乳細胞的擴張生長。同時，正常水分下小麥胚乳淀粉的充實度優于干旱脅迫，干旱脅迫下胚乳細胞中淀粉體的數量較少，淀粉體相對面積顯著小于正常水分處理(圖2E、圖2H和圖3C)。但與正常水分處理相比，干旱脅迫下小麥胚乳細胞中積累的蛋白體數量較多，尺寸大，蛋白體的相對面積也較大(圖2E、圖2H和圖3D)。

花后20 d，正常水分下小麥的胚乳細胞基本被淀粉體充實，蛋白體游離分布于淀粉體間隙中。而干旱脅迫下小麥的胚乳細胞未完全充實，在淀粉體間存在較大的空隙，積累了一些大的蛋白體(圖2F,圖2I)。與正常水分處理相比，干旱脅迫下胚乳細胞中淀粉體的相對面積無顯著變化，但蛋白體的相對面積顯著增加(圖3C和圖3D)。

花后25 d，胚乳細胞完全被充滿，并且淀粉體相互擠壓變形，蛋白體體積增大，充實于淀粉體間隙。干旱脅迫下小麥胚乳細胞中蛋白體的積累量增加，蛋白體的相對面積顯著大于正常水分處理，并且一些小的蛋白體聚集在一起，形成了較大的蛋白體(圖2G、圖2J)。

以上結果表明，在穎果發育早期，干旱脅迫能促進胚乳細胞的分裂和生長，加速胚乳發育。但隨干旱時間持續，胚乳細胞的進一步擴張受到抑制。同時，干旱脅迫阻礙了胚乳細胞中淀粉體的充實，但提高了蛋白體的積累量。

2.3 干旱脅迫下穎果內源激素含量的變化

由圖4A可知，小麥穎果從花后發育至灌漿成熟階段IAA含量的變化呈單峰曲線。從花后5 d開始，IAA含量持續升高，到花后25 d達到最大值，之后隨穎果成熟其IAA含量快速下降。在穎果發育前期，干旱脅迫下小麥穎果的IAA含量顯著高于正常水分處理，且花后15 d時兩者差距達到最大(為11.42%)，但花后25 d后，其IAA含量顯著低于正常水分處理。說明干旱脅迫能提高小麥發育前期穎果的IAA含量，促進穎果的前期發育。

無論是干旱脅迫還是和正常水分處理，小麥穎果的ABA含量均呈先升后降的變化趨勢(圖4B)。在穎果發育早期ABA含量快速增加，在花后10 d達到最大值，之后隨灌漿持續和籽粒成熟而逐漸降低。花后5 d，干旱脅迫處理下小麥穎果的ABA含量較正常水分處理提高了40.15%，且在之后整個穎果的發育過程中，其ABA含量一直顯著高于正常水分處理。表明干旱脅迫能提高穎果中ABA的積累，從而發揮ABA的生理作用，調控小麥對干旱的響應。

A、B、E、F、G分別為正常水分下小麥穎果花后5、10、15、20、25 d的胚乳結構；C、D、H、I、J分別為干旱脅迫下小麥穎果花后5、10、15、20、25 d的胚乳結構；Nu：細胞核；SG：淀粉體；PB：蛋白體。

隨小麥穎果發育，GA3含量逐漸下降，GA4含量則呈先升后降的變化趨勢，且于花后20 d時達到最大值(圖4C和圖4D)。在發育早期，干旱脅迫下小麥穎果的GA3含量略高于正常水分處理，花后15 d之后略低于正常水分處理，但兩者間的差異始終未達到顯著水平。而干旱脅迫下小麥穎果的GA4含量在花后15 d之前顯著高于正常水分處理，隨后則顯著降低。

小麥穎果的ZR含量隨發育過程推進呈先升后降的變化趨勢，在發育早期，干旱脅迫下穎果的ZR含量顯著高于正常水分處理，且在花后5 d時較正常水分處理高13.23%；花后15～25 d，干旱脅迫下小麥穎果的ZR含量顯著低于正常水分處理(圖4E)。

DHZR含量隨小麥穎果發育呈逐漸下降的變化趨勢，花后5 d，小麥穎果的DHZR含量最高，且干旱脅迫下穎果的DHZR含量較正常水分處理高5.14%(P<0.05)；之后，隨穎果發育，DHZR含量逐漸下降，在花后15～20 d，干旱脅迫穎果中的DHZR含量顯著低于正常水分處理(圖4F)。

綜上所述，在穎果發育過程中各類激素的變化規律各不相同，并且對干旱脅迫的響應也不一致。干旱脅迫下，小麥穎果的IAA、GA3、GA4、ZR和DHZR含量在發育前期均高于正常水分處理，發育后期則低于后者。但在穎果整個發育過程中，干旱脅迫下小麥穎果ABA含量始終高于正常水分處理。

3 討 論

內源性激素作為植物逆境脅迫的響應因子，在應對干旱脅迫時發揮重要作用。植物在干旱脅迫下會引起自身內源激素含量和活性的改變，從而調控植物的生理生化過程以及同化產物的運輸和分配[10]。ABA作為主要的內源性激素之一，在植物的抗逆生長，尤其是在水分脅迫下具有重要的調控作用，甚至被認為是衡量作物抗旱性的潛在指標。ABA參與調控植物生長發育中的各種生理過程，包括氣孔開閉、種子發育、胚胎形態建成以及蛋白等儲藏物質的合成[20]。普遍認為，干旱脅迫能夠顯著提高ABA含量，在導致生理變化的同時調控多種脅迫應答基因的表達，如LEA蛋白、脫水蛋白、擴展蛋白等脅迫應答蛋白[21]。研究表明，小麥在遭受干旱脅迫時，首先在根部快速合成ABA，之后通過木質部和韌皮部運輸至各營養器官和生殖組織，導致穎果中ABA含量升高，并通過調控細胞分裂、碳代謝酶活性等相關基因的表達，影響穎果的生長發育[22]。本研究中，干旱脅迫提高了穎果整個發育過程中的ABA含量，且干旱脅迫能促進穎果的早期發育，抑制后期發育，這可能是由干旱誘導的穎果中高含量ABA調控不同的生理過程造成的。在穎果發育早期，ABA含量升高誘導擴展蛋白表達上調，擴展蛋白活性提高，促進細胞的伸長生長[23]，因此穎果發育加快，導致胚乳面積增加。隨穎果的發育，干旱誘導的高ABA含量主要從3個方面影響穎果生長：首先，ABA能通過抑制細胞周期相關基因的表達阻礙胚乳細胞的分裂[24]；其次，ABA能誘導氣孔關閉，降低光合作用，減少碳水化合物的供應比率，進而導致穎果儲藏物質積累的下降[25]；再者，ABA能通過影響碳水化合物催化酶活性擾亂穎果中的碳代謝[26]。總之，不論是在穎果發育的早期還是后期，ABA調控穎果發育對干旱脅迫響應的最終目標是達到保證自身存活和生產力的最佳平衡。

*表示干旱脅迫處理與對照之間在0.05水平下差異顯著。下圖同。

圖4 干旱脅迫下小麥穎果中內源激素含量的變化

小麥穎果發育受內源激素的調控，籽粒的形態建成以及灌漿充實過程均有內源激素的參與[27]。諸多研究認為，IAA和GAs與同化物的調運密切相關，參與調控了同化物質在籽粒庫中的積累和轉化[28]。閆 潔等[29]研究認為，較高的IAA含量有利于光合產物向籽粒轉運，加快灌漿速率。Pharis和King[30]的研究指出，GAs的生化合成及含量的動態變化與穎果的發育進程一致。本研究中，在穎果發育前期，干旱脅迫誘導IAA和GA4的積累，加快發育進程，表現出胚乳淀粉積累的增加。而到發育后期，干旱脅迫抑制穎果中IAA和GA4的積累，從而阻礙了同化物向穎果的轉運，這與干旱脅迫下胚乳細胞淀粉充實度不佳的結果一致。前人研究表明，較高的GA3含量會增強α-淀粉酶等水解酶活性[31]，而本研究中，隨穎果發育其GA3含量逐漸下降，且干旱脅迫提高了穎果發育早期的GA3含量。這可能是因為在穎果早期發育中果皮發育占主導，而干旱誘導GA3含量的增加促進了果皮淀粉的降解，這與前人的研究結果一致[5]。本研究還發現，干旱脅迫可促進穎果的ABA的積累，而ABA可以加速籽粒成熟并促進貯藏蛋白的積累。

ZR和DHZR是小麥等高等植物體內主要的游離態細胞分裂素，能促進細胞的分裂和生長。研究表明，禾谷類胚乳細胞的分裂和擴大與籽粒細胞分裂素的積累有關[32]。本研究中，干旱脅迫下穎果中的ZR和DHZR含量在發育早期升高，而發育后期，兩者含量均低于正常水分處理。另外，干旱脅迫下，發育早期穎果的胚乳細胞數目多，胚乳面積大，表明干旱能誘導穎果中ZR和DHZR含量的增加，促進胚乳細胞的分裂和生長。總的來說，干旱脅迫會影響小麥穎果中各類激素的積累，而這些激素間相互協調，共同調控胚乳細胞發育和充實，使得穎果生長適應干旱。