砂生槐根瘤內抗小麥紋枯病生防菌株的篩選及其鑒定

何建清，張格杰，趙偉進，王孝先

(西藏農牧學院，西藏林芝 860000)

小麥紋枯病(Rhizotoniacerealisvan der Hoeven apud.Boerema & Verhoeven)又稱立枯病、尖眼斑病，是由禾谷絲核菌(Rhizotoniacerealis) 引起的一種土傳真菌病害[1-2]，其分布范圍甚廣，早在 1934 年即有報道。小麥紋枯病對小麥產量影響較大，發病時一般減產10%～20%，嚴重時減產50%左右，甚至造成枯孕穗、枯白穗，造成顆粒無收[3-4]。近年來，由于氣候變暖、耕作、栽培制度變化等原因，小麥紋枯病的發生和為害日益嚴重，已成為我國小麥高產、穩產的主要障礙之一[5-6]。由于目前尚未發現高抗紋枯病的小麥品種，控制該病害仍主要依靠苯醚甲環唑和戊唑醇處理種子并于春季結合井岡霉素進行化學防治[7]。由于長期單一用藥，已使小麥紋枯病菌對常用殺菌劑產生了不同程度的抗藥性，防治效果明顯降低[1]。因此，探索可替代化學防治的防治方法迫在眉睫。目前，以植物微生態學為基礎控制有害生物的防治技術已成為小麥紋枯病防治研究的熱點[8-9]。

植物內生菌與植物在長期協同進化過程中形成了互惠互利、相互依存的關系。植物內生菌已成為植物微生態系統中的重要組成部分[10]。對根瘤菌與豆科植物共生關系的研究發現，根瘤中同時定殖著許多與根瘤菌不同的內生菌，其中一些非共生細菌不引起植物病害，為根瘤內生細菌[11]。研究表明，根瘤內生菌具有生物固氮、促進植物生長、增強宿主抗逆、抗病能力等功能[12]。近年來，已有利用豆科植物根瘤內生菌防治植物病害、促進植物生長的研究[13-16]。

砂生槐[Sophoramoorcroftiana(Benth.) Baker]又名西藏狼牙刺、刺柴、金雀花等，藏語名“吉瓦”，為豆科槐屬多年生矮灌木，是青藏高原特有種[17]。砂生槐主要分布在雅江流域中段的寬谷、兩側低山及拉薩河、年楚河等主要支流的寬谷內，具有良好的防風固沙、涵養水源等重要生態作用[18]。目前對砂生槐的研究主要集中在種群和群落結構、繁殖特性、固沙特性和物種多樣性等方面[19-21]，尚未見從砂生槐根瘤中篩選植物病原菌拮抗內生細菌的研究。本研究擬從砂生槐根瘤中分離、篩選對小麥紋枯病菌的拮抗細菌，并對其進行生物學和抑菌性研究，為根瘤內生菌的開發和利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物病原菌：小麥紋枯病菌(R.cerealis)由西藏農牧學院生物技術中心真菌室提供。供試培養基參考李振高等[22]的方法配制。供試根瘤內生細菌：從米林縣采集健康砂生槐的根瘤，分離獲得編號R1～R45共45株根瘤內生細菌用于本研究。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥紋枯病菌拮抗內生細菌初篩

采用兩點對峙法[23]。用滅菌打孔器制備直徑為0.6 cm病原菌菌餅，使用無菌接種針挑起菌餅(有菌面朝下)放于 PDA培養基中央，把2種不同編號內生細菌均勻接種于距平板邊緣約2.5 cm 處，置于28 ℃恒溫培養箱倒置培養 5 d，以不接種內生細菌的病原菌菌落為對照(CK)；觀察并測量培養基中小麥紋枯病菌菌落直徑。按以下公式計算抑菌率。

抑菌率=(對照菌落直徑-對峙培養病原菌菌落直徑)/對照菌落直徑×100%

1.2.2 小麥紋枯病菌拮抗內生細菌復篩

采用菌絲生長速率法[24]。把1.2.1中抑菌率較高的內生菌菌株接種到 NA 液體培養基中，28 ℃、130 r·min-1恒溫振蕩培養 7 d 后，12 000 r·min-1離心 10 min收集上清液，過 0.45 μm 濾膜，在無菌條件下，將除菌發酵濾液與冷卻至55 ℃的 PDA 培養基按1∶9(v/v)混合均勻制成平板，以添加等量無菌水為對照，在平板中央接種生長旺盛的小麥紋枯病菌菌餅(直徑為 0.6 cm)，28 ℃恒溫培養 3～5 d，測量菌落直徑，計算抑菌率。每個處理 3 次重復。

1.2.3 所篩選內生細菌除菌發酵濾液對小麥紋枯病菌的影響

選取大小一致的小麥紋枯病菌的菌核，在75%(v/v)乙醇溶液中處理5 min，無菌水沖洗5～6次，用無菌濾紙吸干水分備用。取1.2.2中抑菌率較高菌株的除菌發酵濾液與PDA培養基按1∶9(v/v)混合均勻制成平板，每個平板接種25個菌核，重復3次，以添加等量無菌水為對照；培養3～7 d，觀察菌核萌發情況。菌核萌發后繼續培養15 d，觀察菌核萌發后形成次生菌核的數量。

在顯微鏡(10×40)下觀察所篩選菌的抑菌圈邊緣小麥紋枯病菌菌絲生長情況，以正常生長的病原菌邊緣菌絲為對照。拍照并記錄結果。

1.2.4 所篩選內生細菌的拮抗譜測定

采用1.2.1方法測定1.2.2中篩選出的強拮抗菌株對番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、小麥根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)、馬鈴薯干腐病菌(Fusariumsulphureum)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、梨黑星病菌(Venturiapiritna)和小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)的抑菌效果。

1.2.5 菌株的固氮、溶磷及產IAA能力測定

固氮能力測定參考胡春錦等[25]的方法，溶磷及產IAA 能力測定參考姚玉玲等[26]的方法。

1.2.6 所選菌株的活體篩選

盆栽試驗參照文才藝等[9]的方法進行。按下式計算病情指數和防治效果。

發病率= 發病株數/總株數 ×100%，

病情指數=[∑(各級病株數×各級嚴重度) /(調查總株數×最高級別嚴重度)]×100

防治效果=[(對照組病情指數-處理組病情指數)/對照組病情指數]×100%

1.2.7 所選菌株的生物學鑒定

形態、生理生化特征測定參考文獻[22] 和[27]的方法。

拮抗菌株對碳源、氮源的利用參考李振高等[22]的方法進行。碳源利用：將不同碳源于112 ℃滅菌20 min后加入已滅菌的基礎培養基中；用接種針蘸取菌懸液接入培養液中，置于30 ℃培養，觀察記錄生長情況。以葡萄糖為陽性對照，無碳培養基為陰性對照。氮源利用：將不同氮源于112 ℃滅菌20 min后加入已滅菌的基礎培養基中；用接種針蘸取菌懸液接入培養液中，置于30 ℃培養，觀察記錄生長情況。以蛋白胨為陽性對照，無氮培養基為陰性對照。供試碳、氮源各15 種(見表4)，每個處理 3 次重復。

16S rDNA 基因擴增、序列測定與系統分析參考孫建光等[28]的方法進行，利用 EzTaxon (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net)和 NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)進行基因序列比對，系統進化分析采用軟件Mega(ver.5.1)進行。

2 結果和分析

2.1 內生拮抗菌株初篩

采用平板對峙培養法對45 株砂生槐根瘤內生細菌進行拮抗試驗，初步篩選出了對小麥紋枯病有拮抗作用的內生細菌共4 株(表 1)，占分離菌株數量的8.89%。不同內生細菌對小麥紋枯病菌的抑菌率不同。4株菌的抑菌圈直徑、菌落直徑和抑菌率差異均顯著；菌株R4的抑菌效果最好，抑菌率為57.11%，其次為菌株R11，抑菌率為45.44%，菌株R24和R25抑菌分別為32.33%和29.03%。

表1 對小麥紋枯病菌拮抗的砂生槐根瘤內生細菌Table 1 Antagonistic endophytic bacteria from Sandliving sophora nodules against Rhizotonia cerealis

同列數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Lower-case letters in same column indicate significant difference at 0.05 level. The same in tables 2-4.

2.2 砂生槐根瘤內生拮抗細菌復篩

由表 2 可知，4株砂生槐根瘤內生細菌除菌發酵濾液對小麥紋枯病菌抑菌率均達到62%以上，其中，抑制率最高為菌株R4，培養5 d時的抑菌率為98.2%；R25的抑菌率較低，其培養5 d時的抑菌率僅為62.9%。綜合初篩和復篩結果，選擇菌株R4開展后續研究。

2.3 菌株R4對小麥紋枯病菌菌核萌發的作用

菌株R4除菌發酵濾液對小麥紋枯病菌菌核萌發的試驗結果(圖1)顯示，菌株R4除菌發酵濾液對小麥紋枯病菌菌核萌發有明顯的抑制作用。7 d后菌株R4除菌發酵濾液處理的小麥紋枯病菌菌核形成菌絲的萌發率為8.0%，而CK的萌發率達到100%；但15 d后，菌株R4除菌發酵濾液處理的菌核全部萌發，說明菌株R4的除菌發酵濾液只是延遲小麥紋枯病菌菌核的萌發而不能殺滅菌核。可能是由于菌核的抗逆性很強的緣故，這一結論還需進一步進行驗證。經觀察，15 d后經菌株R4除菌發酵濾液處理的小麥紋枯病菌菌核萌發后形成次生菌核的數量較對照減少了93.8%。

2.4 菌株R4對小麥紋枯病菌菌絲的作用

觀察可知，對照小麥紋枯病菌菌絲粗細均勻，顏色一致(圖2A) 。菌株R4除菌發酵濾液處理后，小麥紋枯病菌菌絲變粗、節間縮短、小分枝增多，局部原生質濃縮，形成瘤狀結。

表2 拮抗內生細菌代謝液對小麥紋枯病菌的抑菌率Table 2 Inhibitory ratio of endogenous bacterial metabolites on Rhizotonia cerealis %

A:對照；B:菌株R4發酵濾液處理。 A:CK; B:Treated with fermentation filtrate liquid of strain R4.

2.5 菌株R4的抗菌譜

平板對峙試驗結果表明，菌株R4具有較廣的抑菌譜。對供試的番茄灰霉病菌、小麥根腐病菌、玉米大斑病菌、馬鈴薯干腐病菌、油菜菌核病菌、梨黑星病菌和小麥赤霉病菌7種病原真菌均有不同程度的抑制作用。菌株R4對以上7種病原真菌的抑菌圈半徑分別為9、8、11、10、8、6和 9 mm。表明菌株R4對所測試的植物根部病原菌和葉斑病菌均具有良好的抑制作用。

2.6 菌株R4的固氮、溶磷及產IAA性

利用半微量凱氏定氮法測定菌株R4的固定氮量，采用溶磷圈和鉬銻抗比色法測定其有效磷增量，采用 Salkowski 比色法測定菌株分泌植物生長激素(IAA)的功能。結果(表3)表明，菌株R4培養 10 d的固定氮量達到 44.0 mg·L-1，比 CK 增加了 14.06倍；有機磷有效含量為92.70mg·L-1,比CK增加了3.62倍；無機磷有效含量為15.47 mg·L-1，比 CK 增加了1.17倍；分泌 IAA 量為38.25 μg·L-1，比 CK 增加了14.48倍，差異均顯著。

A:對照；B:菌株R4發酵濾液處理。 A:CK; B:Treated with fermentation filtrate liquid of strain R4.

A：小麥赤霉病菌， 菌株R4 處理；B：小麥赤霉病菌，CK； C:馬鈴薯干腐菌，菌株R4 處理；D：馬鈴薯干腐菌，CK。

2.7 菌株R4發酵液對小麥紋枯病的防治效果

盆栽試驗表明，菌株R4發酵液和R4除菌發酵濾液處理小麥紋枯病植株的發病率和病情指數均顯著降低。發酵液和除菌發酵濾液對小麥紋枯病的防治效果分別為73.82%和54.39%；發酵液防治效果顯著優于除菌發酵濾液的，二者的發生率和病情指數顯著優于對照。因此，菌株R4可作為小麥紋枯病的生防菌資源。

表3 培養基及菌株R4發酵液中的氮、磷、IAA含量Table 3 Content of N,P and IAA in culture medium and strain R4 fermentation liquid mg·L-1

表4 拮抗菌R4發酵液對小麥紋枯病的防治效果Table 4 Control effect of fermentation liquid of antagonistic endophytic bacterium strain R4 from Sandliving sophora nodule against Rhizotonia cerealis

2.8 菌株R4形態、生理特征和種類鑒定

菌株R4菌體呈短桿狀，大小為1.0～1.2 μm ×3.0～4.0 μm，革蘭氏陽性菌，能形成芽胞；形成芽胞時，菌體近端膨大，胞囊明顯膨脹；芽胞橢圓形，位于胞囊一端(圖 4A)。

在LB培養平板上，培養 5～7 d 形成直徑為 1～10 mm 左右的菌落，不規則，單菌落平坦，乳白色，不透明，有光澤(圖 4B)。

菌株R4對接觸酶反應呈陽性，對氧化酶反應呈陰性，對吲哚反應呈陰性，甲基紅試驗(M-R試驗)呈陰性，乙酰甲基甲醇試驗(V-P試驗)呈陽性，硝酸鹽還原呈陽性。能水解淀粉，利用葡萄糖和蔗糖時產酸、產氣，可利用乳糖，能使明膠液化，使牛奶胨化，不產硫化氫，可利用檸檬酸鹽。在0～2% NaCl 溶液中生長，最適生長溫度為 30～32 ℃，4 ℃下生長緩慢，生長最適 pH 7～9。

菌株R4可以作為唯一碳源利用的有D-纖維二糖、D-海藻糖、D-果糖、L-鼠李糖、D-山梨醇、D-半乳糖、松三糖、棉子糖、D-甘露糖、D-甘露醇；不能作為唯一碳源利用的有七葉苷、山梨糖、菊糖、L-阿拉伯糖、羧甲基纖維素鈉。

菌株R4利用氮源的種類較多，對提供的15種氮源均能利用(表4)。

將 16S rDNA 序列與 GenBank 數據庫中的序列進行 BLAST 比對，結果表明，菌株 R4 與類芽胞桿菌屬(Paenibacillussp.)的同源性較高，將其與類芽胞桿菌屬全部 11個種的菌株的序列進行遺傳距離計算，用鄰位相連法構建系統進化樹(圖 5)。從圖 5 可知，菌株R4與類芽胞桿菌屬(Paenibacillussp.)的菌株都劃分在同一簇內，且與土地類芽胞桿菌PaenibacillusterraeAM141 菌株(登錄號為AF391124)親緣關系最為接近，相似性為99.2%。根據菌株R4的形態特征、生理生化特性及 16S rDNA 基因序列比對結果，參照《常見細菌系統鑒定手冊》[27]，菌株R4被鑒定為土地類芽孢桿菌Paenibacillusterrae。

A:菌株R4的菌體顯微形態; B:菌株R4 在LB培養基上生長的菌落形態。

表4 菌株R4對部分碳源、氮源的利用Table 4 Utilization of partly carbon sources and nitrogen sources by strain R4

圖5 菌株R4的16S rDNA序列系統進化樹

3 討 論

利用植物內生細菌抑制植物病原微生物的生物防治國內外已開展許多研究，但從豆科植物特殊組織—根瘤中篩選病原菌拮抗菌株的研究較為少見[13]。根瘤內生細菌不僅將植物作為其棲息場所，而且對宿主植物有促生、防病、內生聯合固氮等廣泛的生物學作用。根瘤內生細菌相對于其他組織部位的內生細菌而言，對土壤的適應性更強，用于土傳性病害的生物防治更具優勢[11]。本研究從砂生槐根瘤內分離到45 株內生細菌，經初篩和復篩，發現菌株R4對小麥紋枯病菌具較強拮抗作用；平板試驗中除菌發酵液的抑菌率為98.2%；盆栽試驗中，菌株R4帶菌發酵液和除菌發酵液對小麥紋枯病的防效分別為73.82%和54.39%，說明菌株R4活性代謝物質在其生防過程中發揮重要作用。帶菌發酵液對小麥紋枯病的防治效果顯著高于除菌發酵液，則說明菌株R4活性代謝物質在發揮生防作用的同時，菌體在小麥體內的定殖與其在盆栽土壤中持續發揮防治作用具有密切關系，本研究結果與文才藝等[9]試驗結果類似。

土地類芽胞桿菌(P.terrae)是2003年在印度發現的新種，目前有土地類芽胞桿菌7個菌株被作為功能菌株進行報道[29]。主要為水藻收獲絮凝劑菌株AM141、木聚糖酶產生菌HPL-003、產生N2O 的菌株 MH72、代謝木質素衍生的芳香族化合物的菌株以及于文清等[29]從大豆根周土壤分離到的具有固氮、溶磷、解鉀、活化硅、抑制尖孢鐮刀菌的菌株NK3-4。本研究篩選到的土地類芽胞桿菌R4具有固氮、溶磷、分泌IAA、抗菌譜廣，對小麥紋枯病菌具有較好的防治效果等功能，在國內外未見報道，可為新生物制劑的研發提供新的微生物資源，為化肥、農藥減量化施用的可行性研究提供理論支持。