不同產地知母藥材的含量測定及指紋圖譜研究

陳素娟，張艷秋，聶 靜，楊芊芊，高 歌，張 旗，韓晶晶，蔡程科，李 強*

(1.北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488；2.福建醫科大學藥學院天然藥物學系，福州 350122)

知母始載于《神農本草經》，是百合科植物知母AnemarrhenaasphodeloidesBge.的干燥根莖，具有清熱瀉火和除煩止渴的功效[1]。知母主要分布于我國河北、遼寧、山西、安徽和內蒙等地[2]，其中河北和安徽產量最大。據報道，知母中的主要化學成分包括雙苯吡喃酮類、甾體皂苷類和苯丙素類等[3-4]，具有抗炎、抗腫瘤、解熱鎮痛和降血糖等作用，常用于外感熱病和高熱煩渴等癥的治療[5-6]。研究表明，知母中的芒果苷和新芒果苷是知母中抗炎、抗病毒的主要成分，屬于雙苯吡喃酮類，也是降血糖和改善2型糖尿病癥狀的有效成分[7]。此外，知母中的甾體皂苷也具有重要的藥理活性，研究表明，知母皂苷BⅡ具有抗血栓、改善記憶功能障礙、抗動脈粥樣硬化以及治療老年癡呆等作用，在抗癌方面也有顯著的活性[8-9]。

2017年10月國家食品藥品監督管理總局提出了《中藥經典名方復方制劑簡化注冊審批管理規定(征求意見稿)》[10]，旨在簡化經典名方復方制劑的申報要求。2018年4月國家中藥管理局頒布了《古代經典名方目錄(第一批)》[11]，其中達原飲、升陷湯、二冬湯和玉女煎等多個經典名方中包含中藥知母。意見稿中提出了經典名方的研究需從中藥的原材料開始定性定量，以全面控制原藥材的質量[12]。

指紋圖譜技術是一種充分利用現代化科技手段達到最好表征中藥方劑體系特性的技術，也是反映中藥作用機制的最有效途徑，更是中藥質量控制中最先進的技術。它既能表達成品的質量，用于工藝操作控制和原料輔料的質量控制，又可從指紋圖譜中尋找工藝操作中的問題，從而實現對不同產地藥材的質量控制。中藥材和復方制劑都極其復雜，必須采用多種技術來表征其質量特性[13-17]。中藥指標性成分含量測定和中藥指紋圖譜均能全面體現中藥材的整體質量[18-19]。故本實驗將從指標性成分含量結合指紋圖譜對知母藥材的質量進行評價，為經典名方復方制劑的開發奠定研究基礎。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1100 高效液相色譜儀(包含G1315B DAD檢測器，G1316A柱溫箱，G1312A泵和G1313A自動進樣系統)，Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(美國安捷倫科技有限公司)；BS124S型萬分之一分析天平(賽多利斯公司)；KQ-5200DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DZ-2BCIV型真空干燥箱(天津泰斯特儀器有限公司)。

1.2試藥 乙腈，色譜純(批號173533，賽默飛世爾科技公司)；冰乙酸，分析純(批號20170831，北京化工廠)；乙醇，分析純(批號20160708，天津福晨化學試劑廠)。芒果苷(質量分數≥98.1%，批號111607-201704)，知母皂苷BⅡ(質量分數≥94.5%，批號111839-201706)，均購自中國食品藥品檢定研究院。15批知母藥材均由河北神威藥業有限公司提供，見表1，經北京中醫藥大學劉春生教授鑒定為百合科知母的干燥根莖。

表1 知母藥材信息

Tab.1 The information ofRhizomaAnemarrhenaesamples

編號產地批號S1亳州十九里ZM180311S2亳州十九里ZM180312S3亳州十九里ZM180313S4亳州十九里ZM180314S5亳州十九里ZM180315S6河北張家口ZM180321S7河北張家口ZM180322S8河北張家口ZM180323S9河北張家口ZM180324S10河北張家口ZM180325S11河北安國1708162S12河北安國1708163S13河北安國1708164S14河北安國1708165S15河北安國1708166

2 方法與結果

2.1知母藥材含量測定 根據《中國藥典》2015年版一部知母項下規定，對15批知母藥材中的指標性成分芒果苷和知母皂苷BⅡ進行含量測定。結果表明，15批知母藥材中的指標性成分均符合藥典要求(藥典規定：芒果苷含量不得少于0.700%，知母皂苷BⅡ含量不得少于3.000%)。見表2。

表2 15批知母藥材含量測定結果

Tab.2 The results of content determination of 15 batches ofRhizomaAnemarrhenae

編號芒果苷含量/%知母皂苷BⅡ含量/%S11.2815.841S21.3735.422S31.6874.577S41.4647.332S51.1705.114S61.2045.504S70.9025.377S80.8036.890S91.1805.878S101.1306.043S111.4923.844S121.2814.239S131.6554.061S141.5063.253S151.4053.402

2.2知母藥材指紋圖譜的建立

2.2.1色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，乙腈(A)-1 mL·L-1乙酸(B)梯度洗脫，梯度為：0～5 min，2%A→5%A；5～12 min，5%A→20%A；12～18 min，20%A→25%A；18～23 min，25%A；23～40 min，25%A→100%A；40～45 min，100%A。進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；波長：258 nm。ELSD參數：漂移管溫度：105 ℃；氮氣流速：2.6 L·min-1。

2.2.2供試品溶液的制備 精密稱取各批次知母藥材粉末(過3號篩)0.5 g，加入體積分數為75%的乙醇25 mL，稱定質量，超聲(400 W，40 kHz)處理30 min，取出，放冷，再稱定質量，用體積分數為75%的乙醇補足減失的質量，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.3對照品溶液的制備 分別精密稱取芒果苷和知母皂苷BⅡ對照品適量，置于10 mL量瓶中，用體積分數為70%的乙醇溶解并稀釋至刻度，制成質量濃度均為0.1 mg·mL-1的對照品溶液。

2.3方法學考察

2.3.1精密度考察 取知母藥材粉末(編號S11)，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.2.1項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖。結果表明，各共有峰的相對保留時間和單峰面積占總峰面積10%以上的色譜峰的相對峰面積RSD值均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.3.2穩定性實驗 取知母藥材粉末(編號S11)，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.2.1項下色譜條件，分別于配制后0，2，4，8，12，24，36和48 h進樣，記錄色譜圖。結果表明，各共有峰的相對保留時間和單峰面積占總峰面積10%以上的色譜峰的相對峰面積RSD值均小于3%，表明48 h內供試品溶液穩定性良好。

2.3.3重復性實驗 精密稱取同一批次(編號S11)知母藥材粉末，按照2.2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按照2.2.1項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。結果表明，各共有峰的相對保留時間和單峰面積占總峰面積10%以上的色譜峰的相對峰面積RSD值均小于3%，表明本方法重復性良好。

2.4指紋圖譜的建立 精密吸取2.2.2項下制備的15批次知母藥材供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀中，按照2.2.1項下色譜條件進樣分析，記錄指紋圖譜色譜峰信息。HPLC-UV指紋圖譜見圖1。生成的對照指紋圖譜見圖2，共有峰為4個。HPLC-ELSD指紋圖譜見圖3。生成的對照指紋圖譜見圖4，共有峰為7個。2張指紋圖譜共有峰用對照品對照共指認了2個，分別是圖2中的3號峰為芒果苷和圖4中的4號峰為知母皂苷BⅡ。

圖1 15批知母藥材HPLC-UV指紋圖譜

Fig.1 HPLC-UV fingerprint of 15 batches ofRhizomaAnemarrhenae

2.4.1參比峰的選擇 對照指紋圖譜中，以保留時間相對較穩定且峰面積較大的芒果苷(3號峰)為知母藥材HPLC-UV-ELSD指紋圖譜的參照峰。

圖2 知母藥材HPLC-UV對照指紋圖譜

1～4.指紋特征峰；3.芒果苷。

Fig.2 The control fingerprint of HPLC-UV ofRhizomaAnemarrhenae

1-4.characteristic fingerprint peaks;3.mangiferin.

圖3 15批知母藥材HPLC-ELSD指紋圖譜

Fig.3 The HPLC-ELSD fingerprint of 15 batches ofRhizomaAnemarrhenae

圖4 知母藥材HPLC-ELSD對照指紋圖譜

1～7.指紋特征峰；4.知母皂苷BⅡ。

Fig.4 The control fingerprint of HPLC-ELSD ofRhizomaAnemarrhenae

1-7.characteristic fingerprint peaks;4.saponins BⅡ.

2.4.2指紋圖譜的相似度評價 將數據導入中藥指紋圖譜相似度評價系統(2004A版)軟件，進行峰點校正和數據匹配，運用中位數法建立對照指紋圖譜。計算15批待測指紋圖譜與對照圖譜的相似度，見表3。

表3 15批知母藥材指紋圖譜相似度結果

Tab.3 Similarity results of fingerprints of 15 batches ofRhizomaAnemarrhenae

編號UV相似度ELSD相似度S10.9950.997S20.9930.994S30.9940.996S40.9940.994S50.9940.995S60.9580.957S70.9810.943S80.9690.927S90.9570.915S100.9780.962S110.9730.956S120.9980.968S130.9850.971S140.9750.965S150.9570.959

3 討論

本實驗采用HPLC-UV-ELSD指紋圖譜測定法從含量測定及指紋圖譜2個方面定性定量反映了藥材的整體質量，較近幾年的研究[20-21]更全面。

3.1供試品制備方法的選擇 本實驗分別考察了超聲提取法、萃取法和回流提取法3種供試品制備方法，結果3種方法無較大差異，由于超聲提取法耗時少且操作簡單，最終選擇超聲提取法作為指紋圖譜供試品制備方法。考察了體積分數分別為95%，75%和50%的乙醇、甲醇以及體積分數分別為75%和50%的甲醇作為提取溶劑的差異。此外，還考察了不同超聲提取時間(30，60和90 min)對供試品制備的影響。結果表明，體積分數為75%的乙醇作為提取溶劑時，色譜圖峰形較好，基線較平，而3個提取時間基本無差異，最終選擇體積分數為75%的乙醇超聲提取30 min制備供試品。

3.2流動相的選擇 本實驗比較了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-1 mL·L-1甲酸、乙腈-2 mL·L-1甲酸、乙腈-1 mL·L-1乙酸和乙腈-2 mL·L-1乙酸6種流動相組成，結果發現，乙腈-1 mL·L-1乙酸作為流動相時峰形較好，基線平穩，分離度較好，因此選擇乙腈-1 mL·L-1乙酸作為流動相。

3.3條件的優化 本實驗考察了不同的柱溫(25，30，35 ℃)、不同的流速(0.8，0.9和1.0 mL·min-1)、不同的漂移管溫度(100，105和110 ℃)和不同的氮氣流速(2.3，2.6和2.8 L·min-1)的影響，經過綜合分析色譜峰的峰形、分離度、基線平穩程度、色譜柱和儀器的適用性以及操作簡便性等多方面因素，最終選擇柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL·min-1，漂移管溫度為105 ℃，氮氣流速為2.6 L·min-1為知母藥材指紋圖譜分析的條件。

本實驗初步建立了知母藥材的全面評價模式，該方法簡單易行、重復性好，可為含有中藥知母的經典名方復方制劑的研究提供參考。