礦物粉塵誘導基因對肺癌細胞順鉑敏感性的影響

汪慶 耿鋒 周昊旻 陳業成 趙洪文

中國醫科大學附屬第一醫院呼吸與危重癥醫學科,沈陽 110001

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一,是世界上癌癥死亡的主要原因[1]。在最近的幾十年里,肺癌發病率和病死率顯著增加,并將在未來的幾年中持續升高[2]。目前,以順鉑(cisplatin,DDP)為基礎的聯合化療仍是晚期非小細胞癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的一線治療方案,然而其效果往往欠佳,這主要由于在化療過程中腫瘤細胞易對DDP 等藥物產生多藥耐藥所致(multidrug resistance,MDR)[3]。礦物粉塵誘導基因(mineral dust-induced gene,mdig),是2005年從煤礦工人的肺泡巨噬細胞中發現的新肺癌相關致癌基因,隨后發現其與myc誘導核抗原53(mina53)和核蛋白52是同一基因[4-6]。既往研究已經證明,mdig是c-myc的下游靶基因,在腫瘤細胞的增殖、生長、分化、侵襲和遷移、以及基因組穩定性等方面起著重要的調節作用[4-5,7-9]。因此,mdig被認為在肺癌的發生、發展過程中起重要作用。然而,mdig與肺癌耐藥之間的關系國內外未見報道。

本研究以A549(肺腺癌細胞)和A549/DDP(肺腺癌耐DDP細胞)為靶細胞,通過mdig沉默和過表達技術,探討mdig對A549細胞DDP敏感性的影響,以闡明mdig在肺癌DDP 耐藥中的作用,從而為肺癌有效的靶向治療提供一種新的治療方法。

1 材料與方法

1.1 細胞系與細胞培養 選擇人肺腺癌細胞系A549細胞和肺腺癌耐DDP 細胞系A549/DDP 細胞進行實驗。A549細胞購自中國科學院,A549/DDP 細胞購自北納創聯。將A549 細胞在含有10%胎牛血清(美國Hyclone公司)的RPMI-1640培養基(美國Hyclone 公司)中于37 ℃、5%CO2細胞培養箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)的濕潤環境中生長,將A549/DDP 細胞在有DDP的培養基(終濃度1 mg/L)中培養以維持其耐藥性。

1.2 腫瘤細胞的穩定轉染 mdig過表達的慢病毒載體(LV-mdig 組,GenBank accession NM _032778)和相對應的慢病毒載體(Vector 組),mdig沉默的慢病毒載體(LV-mdig RNAi組,引物 序 列：5'-GGGTGATTTGTTGTACTTT-3')和相對應的慢病毒載體(LV-con 組,引物序列：5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3')均購自吉凱基因(上海吉凱基因化學技術有限公司)。將2.5 ml(5×104個/ml)A549 細胞在轉染前一天接種在T 12.5的培養瓶中(美國Corning公司),于37 ℃、5%CO2的條件下培養,待細胞融合度達到30%～50%時,按照A549 細胞的復染指數(MOI=50)進行病毒感染。16 h后進行換液再孵育48 h,隨后在倒置熒光顯微鏡(德國Zeiss Gmb H 公司)下觀察細胞的轉染效率,并用GFP熒光模塊鑒定的GFP 陽性細胞的百分比表示。將穩定轉染的細胞繼續換液、傳代及凍存,作為后續實驗進行使用。

1.3 細胞毒性試驗 采用CCK-8 試劑盒(美國MCE公司)測定細胞毒性,具體實驗步驟按照試劑盒說明書進行,即：取對數生長期的目的細胞,消化吹打后分別以每孔約5×103個細胞數接種于96孔板上(100μl/孔),用只加RIPA 1640 培養基作為空白對照,每組設置3個復孔,培養24 h,然后依次加入不同濃度的DDP(美國MCE 公司)孵育24 h后加入CCK-8溶液10μl/孔,再孵育1～2 h后用酶標儀(瑞士Tecan infinnite M200 PRO公司)測定450 nm 處的吸光度(optical density,OD)值,細胞活力=(實驗組平均OD 值-空白對照組平均OD 值)/(陰性對照組平均OD 值-空白對照組平均 OD 值)×100%,最后用Graphpad Prism 7.0軟件計算各組細胞對DDP 的半數抑制濃度(50% inhibition concentration,IC50)。每個實驗至少重復3次。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)

采用TRIzol試劑(美國Ambion公司)提取各組目的細胞的總RNA,參照Takara試劑盒說明書先反轉錄合成cDNA,以actin基因為檢測的內參照,實驗所用的PCR 引物由寶生物工程(大連)有限公司進行合成,引物序列如表1 所示,設置PCR 反應的條件為95℃預變性30 s,95 ℃5 s、60 ℃30 s,循環40次,95 ℃5 s、60 ℃1 min、95 ℃15 s和50 ℃30 s,然后采用實時熒光定量PCR 議(瑞士Roch公司)測定其循環閾值,最后使用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對比值[10]。

表1 靶基因引物序列

1.5 蛋白質印跡法(Western blot) 各組目的細胞均用含有10% PMSF 的RIPA 裂解液在冰上提取細胞總蛋白,然后用BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白濃度的測定,采用SDS-PAGE 凝膠電泳分離總蛋白(30μg),轉膜90 min,脫脂牛奶室溫阻滯2 h,TBST 洗膜3次,每次15 min,然后按一定的比例孵育如下一抗：抗-mina53(美國Santa Cruz公司),和抗-GAPDH(美國Cell Signaling Technology公司),4℃過夜后,TBST 洗膜3次,每次15 min,孵育辣根過氧化物酶結合的二抗2 h(抗兔IgG,中山金橋公司;抗鼠IgG,中山金橋公司),ECL 發光 顯 影(美 國Bio-Rad 公 司),Image J軟件分析目的基因與GAPDH 的灰度值百分比。每個實驗至少重復3次以上。

2 結果

2.1 構建mdig沉默和過表達A549細胞 采用倒置熒光顯微鏡分別在明場視野×100,同一個視野的GFP熒光場×100、×400進行拍照,可見細胞狀態良好,轉染效率較高(達到90%以上)(圖1、2),并用qRT-PCR 和Western blot加以驗證。結果顯示：較A549 組和LV-con組相比,LV-mdig RNAi組顯著降低了A549細胞中mdig m RNA 和蛋白的表達水平(F=27.8、19.4,P值均＜0.01),見圖3、4;而較A549 組和Vector組相比,LV-mdig 組明顯增加了A549 細胞中mdig m RNA 和蛋白的表達水平(F=42.0、124.8,P值均＜0.01),見圖5、6。

2.2 mdig在A549和A549/DDP細胞中的基礎表達 為了探討mdig與腫瘤細胞鉑類耐藥之間的關系,本研究首先檢測了A549和A549/DDP細胞中mdig的基礎表達。qRT-PCR 和Western blot結果顯示,A549/DDP細胞中mdig m RNA 和蛋白表達均明顯高于A549細胞(t=4.8、9.7,P值均＜0.01),表明mdig可能與肺癌細胞DDP 耐藥有關(圖7、8)。

2.3 mdig抑制A549 細胞對DDP 的敏感性 為了進一步探討mdig對肺癌細胞DDP 敏感性的影響,本研究首先檢測了A549細胞和A549/DDP細胞對DDP的IC50。結果發現：A549/DDP細胞的IC50明顯高于A549細胞[(93.8±8.7)mg/L比(29.9±1.4)mg/L,t=12.6,P＜0.01],其耐藥系數為3.14(圖9)。

圖1 倒置熒光顯微鏡下A549細胞mdig沉默轉染效率和細胞形態

圖2 倒置熒光顯微鏡下A549細胞mdig過表達轉染效率和細胞形態

圖3 實時熒光定量PCR 檢測每組細胞mdig mRNA 的表達

考慮到DDP 耐藥株A549/DDP 細胞中mdig表達高于A549細胞,我們進一步分別過表達和沉默A549 細胞中mdig 后,再測定過表達和沉默mdig后的A549 細胞對DDP 的IC50,結果發現：A549 細胞mdig 過表達后其IC50 值明顯增高[LV-mdig 組IC50 值 為(176.9±13.4)mg/L,A549組IC50值為(29.9±1.4)mg/L,Vector組IC50值為(37.6±1.98)mg/L,F=309.0,P＜0.01](圖10),而A549細胞mdig沉默后其IC50值則 明 顯 降 低 [LV-mdig-RNAi 組IC50 值 為(10.8±1.4)mg/L,A549 組IC50 值為(29.9±1.4) mg/L,LV-con 組IC50 值 為(26.7±1.1)mg/L,F=146.7,P＜0.01](圖11)。

圖4 蛋白質印跡法檢測每組細胞mdig蛋白的表達

圖5 實時熒光定量PCR 檢測每組細胞mdig mRNA 的表達

圖6 蛋白質印跡法檢測每組細胞mdig蛋白的表達

圖7 實時熒光定量PCR 檢測2種細胞系中礦物粉塵誘導基因m RNA 的表達

圖8 蛋白質檢測法檢測2種細胞系中mdig蛋白的表達

圖9 CCK-8法檢測經不同濃度的順鉑處理48 h后的A549和A549/DDP細胞 A：細胞活力;B：順鉑的IC50值

圖10 CCK-8法檢測mdig過表達的A549細胞 A：細胞活力;B：順鉑的IC50值

圖11 CCK-8法檢測mdig沉默的A549細胞 A：細胞活力;B：順鉑的IC50值

3 討論

肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因,NSCLC 占所有肺癌病例的85%。肺腺癌是NSCLC中的一個主要類型,約占NSCLC 的40%左右,其發病率近幾年來逐漸升高,ⅢB/Ⅳ期NSCLC的總體5年生存率為1%～5%。大約70%的NSCLC患者被確診時已經伴有局部轉移,只能通過化療來延長患者的生命和提高其生活質量[11-15]。DDP是晚期肺癌患者最重要的化療藥物之一,屬于一線用藥,然而隨著肺癌對DDP 的耐藥性越來越突出,使得DDP 治療效果差強人意,這是導致肺癌化療失敗的主要原因。MDR 的產生是多基因參與的復雜過程,但目前包括DDP在內的化療藥物的MDR 機制仍未完全闡明,所以迫切需要尋找新的耐藥相關基因。

mdig是肺癌相關的一個原癌基因,其在肺癌組織和大多數肺癌細胞系中高度表達,但在正常肺組織中不表達[4]。目前的研究已經證實,mdig除了肺癌以外,在多種腫瘤中高度表達,如乳腺癌、結腸癌、肝癌、腎細胞癌、神經細胞瘤等[16-21],而且在腫瘤進展中具有不同的生物學作用,包括調控腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移、分化和基因組穩定性等[4-5,7-9],但是,關于mdig 與腫瘤耐藥是否有關鮮見報道,目前僅有Huo等[22]于2017年報道過mdig與體外肝細胞對索拉非尼的耐藥有關,他們發現mdig沉默后能顯著增加Huh7細胞(人肝癌細胞)和MHCC-97 H 細胞(人高轉移潛能肝癌細胞)對索拉非尼的敏感性,具體的耐藥機制未進一步探討,而肺癌和其他腫瘤細胞中關于mdig 和DDP敏感性之間的關系國內外尚未見報道。

為了研究mdig與肺癌細胞DDP 耐藥的關系,本研究發現,相比于肺腺癌A549細胞,肺腺癌耐DDP細胞A549/DDP 中mdig m RNA 和蛋白的表達均增加,提示mdig可能與肺癌DDP 耐藥相關。為了進一步探討mdig對肺癌細胞DDP 敏感性的影響,首先檢測A549 和A549/DDP 細胞對DDP的IC50,結果顯示A549/DDP細胞的IC50明顯高于A549細胞,表明A549/DDP 細胞對DDP 的敏感性低于A549細胞。在此基礎上,進一步分別過表達(LV-mdig組)和沉默(LV-mdig RNAi組)A549 細胞中mdig 后,再測定各組目的細胞對DDP IC50,結果顯示：A549細胞中mdig過表達后其IC50值明顯增高,而A549細胞中mdig沉默后其IC50值則明顯降低,表明mdig過表達能夠抑制肺腺癌A549細胞對DDP的敏感性,而mdig沉默能增加A549 細胞對DDP 的敏感性。這些結果提示mdig通過降低肺癌細胞對DDP的敏感性,從而導致對DDP 的耐藥。然而,其具體的耐藥機制及調控通路尚需進一步探討。

總之,本研究發現肺癌細胞mdig的表達與肺癌細胞DDP耐藥有關,這可能將為進一步研究肺癌細胞的耐藥機制提供實驗依據,并為肺癌耐藥相關基因的治療提供一個新靶點,具有重要的臨床意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突