原發性痛風性關節炎患者外周血單個核細胞三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白G2變化情況及其意義研究

文鐘，青玉鳳，周京國，謝文光，易婷，朱丹，陳剛，李夢蘭，童曉霞

痛風是由于血尿酸水平異常升高，尿酸鹽（MSU）晶體析出并沉積于組織或器官引起的一組臨床綜合征［1］。空腹血尿酸水平男性 ＞420 μmol/L（7.0 mg/dl）、女性 ＞357 μmol/L（6.0 mg/dl））即為高尿酸血癥。高尿酸血癥是痛風發病的生化基礎，嘌呤代謝紊亂和尿酸排泄減少均可導致血尿酸升高。而在血尿酸生成增多的原因中嘌呤代謝紊亂導致血尿酸生成增多僅占10%，剩下的90%均與尿酸轉運蛋白導致尿酸排泄減少有關［2］。三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白G2（ABCG2）作為一種重要的尿酸轉運蛋白，在促進尿酸排泄中起關鍵性作用。研究顯示，歐洲人群中10%的痛風患者跟ABCG2異常表達相關［3］。既往國內外對ABCG2尿酸轉運的相關研究主要集中于腎臟、肝臟、腸道、膽管的ABCG2表達，方法也主要集中于動物模型的構建及細胞轉染技術［3-6］。針對痛風患者外周血單個核細胞（PBMCs）的ABCG2研究尚未發現相關報道。為此，本研究通過RT-qPCR、Western blotting法比較男性原發性痛風性關節炎患者與健康體檢者PBMCs ABCG2 mRNA及蛋白的表達差異，進一步探討ABCG2在原發性痛風性關節炎發病過程中可能起到的作用，以期為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入標準：符合1977年美國風濕病協會（ACR）制定的原發性痛風性關節炎相關診斷標準［7］；初診患者；未進行任何治療（包括抗炎鎮痛及降尿酸藥物治療）。排除標準：血液系統疾病；腎臟疾病；藥物等引起的繼發性痛風；自身免疫性疾病和其他炎性疾病。選取2016年6月—2017年2月于川北醫學院附屬醫院風濕免疫科門診就診及住院的男性原發性痛風性關節炎患者（GA組）82例，其中急性期痛風（AGA亞組）和間歇期痛風（IGA亞組）患者各41例。年齡17～80歲，平均年齡（46±16）歲。依據患者血尿酸水平進一步分為血尿酸＜420 μmol/L痛風亞組（NUA亞組）31例、血尿酸≥420 μmol/L痛風亞組（HUA亞組）51例。

另選取同期川北醫學院附屬醫院體檢中心的男性健康體檢者（HC組）46例，年齡18～78歲，平均年齡（47±13）歲。本研究經川北醫學院附屬醫院倫理委員會批準，受試者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器與試劑

1.2.1.1 主要儀器 紫外分光光度計（Agilent 公司），低溫高速離心機5417R（Eppendorf 公司），Q12K Flex型RT-qPCR儀（Applied Biosystem公司，美國），PCR擴增儀（BIO-RAD公司，美國），電泳儀（BIO-RAD公司，美國），凝膠成像系統（BIO-RAD公司，美國），電泳儀（BIO-RAD公司，美國），小型垂直式蛋白質電泳槽（BIO-RAD公司，美國），轉膜儀（BIO-RAD公司，美國），酶標儀（Benchmark公司，德國），-80 ℃超低溫冰箱（青島海爾股份有限公司）。

1.2.1.2 主要試劑 人外周血淋巴細胞分離液（天津灝洋生物公司），Trizol試劑（Invitrogen公司），熒光染料試劑盒Power SYBR Green PCR Master Mix（ABI公司，美國），瓊脂糖（北京艾德萊生物科技有限公司），GreenView核酸染料（成都博瑞克生物技術有限公司），聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜，BIO-RAD公司，美國），GAPDH抗體（Ruiying Biological公司），ABCG2抗體（Abcam公司，美國），辣根過氧化物酶（HRP）標記的免抗鼠IgG二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.2.2 設計引物 依據Gene Bank中人ABCG2及內參β-肌動蛋白（β-actin）進行序列設計，并用于RT-qPCR檢測。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。

1.2.3 檢測指標 采集受試者清晨空腹靜脈血，采用全自動生化分析儀（ Beck Man Coulter Unicel DxC 800）檢測血尿酸、肌酐、胱抑素C（Cys-C）、超敏C反應蛋白（hs-CRP）水平；采用血細胞分析儀（LH750）檢測紅細胞沉降率（ESR）。

1.2.4 血標本采集及PBMCs提取 采集受試者清晨空腹外周靜脈血5 ml（肝素鈉抗凝），3 000 r/min離心5 min（離心半徑20 cm）分離血漿，加入等量磷酸緩沖鹽溶液（PBS）混勻，將已混勻的靜脈血緩慢加入人淋巴細胞分離液，2 000 r/min離心5min（離心半徑20 cm）分離PBMCs，加入3 ml PBS，2 000 r/min離心10 min（離心半徑20 cm），再轉移至1.5 ml焦碳酸二乙酯（DEPC）處理的EP管中備用。

1.2.5 PBMCs總RNA提取及cDNA制備 將提取的PBMCs加入Trizol試劑，嚴格按照操作提取總RNA，以紫外分光光度儀測定RNA。D260/D280在1.8～2.0為合格。將合格的RNA濃度調整為100 ng/ml。cDNA的合成嚴格按照反轉錄試劑盒說明書，第一步反轉錄反應條件為：42 ℃ 2 min；第二步反轉錄反應條件為：42 ℃ 15 min；終止反應。將cDNA產物于-80 ℃凍存備用。

1.2.6 RT-qPCR法檢測PBMCs ABCG2 mRNA表達水平 將cDNA以20 μl反應體系進行RT-qPCR擴增：SYBR? Premix Ex Taq ? Ⅱ （2X）10.00 μl，ROX Dye Ⅱ（50×） 0.40 μl，上游引物（10 μmol/L）0.15 μl，下游引物（10 μmol/L）0.15 μl，cDNA 2.00 μl，雙蒸水7.30 μl。反應條件：95℃預變性10 min，兩步法擴增：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min共40個循環。操作均在Q12K Flex型RT-qPCR擴增儀中進行，以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA表達水平。

1.2.7 Western blotting法檢測PBMCs ABCG2表達水平PBMCs提取步驟同上，取40 μl進行凝膠電泳、轉膜、電轉，脫脂奶粉封閉液封閉1 h。加入特異性一抗（兔抗人ABCG2抗體或GAPDH抗體），4 ℃孵育過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液（TBST）洗滌后加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗室溫孵育2 h，洗滌后曝光顯影。采用Image J圖像分析軟件掃描分析條帶灰度值，以目的蛋白與GAPDH的條帶灰度值比值代表目標蛋白的相對表達水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；非正態分布計量資料以M（QR）表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗；相關性分析采用Spearman秩相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PBMCs ABCG2 mRNA表達水平比較 GA組PBMCs ABCG2 mRNA表達水平高于HC組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

表1 ABCG2及β-actin引物序列Table 1 ABCG2 and beta-actin gene primer sequences

表2 GA組與HC組PBMCs ABCG2 mRNA表達水平比較〔M（QR）〕Table 2 Expression of ABCG2 mRNA in PBMCs in GA group and HC group

AGA亞組、IGA亞組、HC組PBMCs ABCG2 mRNA表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中IGA亞組PBMCs ABCG2 mRNA表達水平高于AGA亞組，差異有統計學意義（P＜0.05）；HC組PBMCs ABCG2 mRNA表達水平低于IGA亞組，差異有統計學意義（P＜0.05）；AGA亞組與HC組PBMCs ABCG2 mRNA表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表3）。

表3 AGA亞組、IGA亞組、HC組PBMCs ABCG2 mRNA表達水平比較〔M（QR）〕Table3 Expression of ABCG2 mRNA in PBMCs in AGA subgroup，IGA subgroup and HC group

NUA亞 組、HUA亞 組、HC組 PBMCs ABCG2 mRNA表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中HUA亞組PBMCs ABCG2 mRNA表達水平高于NUA亞組，差異有統計學意義（P＜0.05）；HC組PBMCs ABCG2 mRNA表達水平低于HUA亞組，差異有統計學意義（P＜0.05）；NUA亞組與HC組PBMCs ABCG2 mRNA表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表4）。

表4 NUA亞組、HUA亞組、HC組PBMCs ABCG2 mRNA表達水平比較〔M（QR）〕Table 4 Expression of ABCG2 mRNA in PBMCs in NUA subgroup，HUA subgroup and HC group

2.2 PBMCs ABCG2表達水平比較 AGA亞組、IGA亞組、HC組PBMCs ABCG2表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中IGA亞組PBMCs ABCG2表達水平高于AGA亞組，差異有統計學意義（P＜0.05）；HC組PBMCs ABCG2表達水平低于IGA亞組，差異有統計學意義（P＜0.05）；AGA亞組與HC組PBMCs ABCG2表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表5、圖1）。

表5 AGA亞組、IGA亞組、HC組PBMCs ABCG2表達水平比較（±s）Table 5 Expression of ABCG2 protein in PBMCs in AGA subgroup，IGA subgroup and HC group

表5 AGA亞組、IGA亞組、HC組PBMCs ABCG2表達水平比較（±s）Table 5 Expression of ABCG2 protein in PBMCs in AGA subgroup，IGA subgroup and HC group

注：與AGA亞組比較，aP＜0.05；與IGA亞組比較，bP＜0.05

組別 例數 ABCG2 AGA亞組 41 0.45±0.16 IGA亞組 41 0.73±0.27a HC組 46 0.48±0.14b F值 5.858 P值 0.008

圖1 Western blotting 法檢測AGA亞組、IGA亞組、HC組PBMCs ABCG2 表達水平的凝膠電泳圖Figure 1 Gel electrophoresis of expression of ABCG2 protein in PBMCs in AGA subgroup，IGA subgroup and HC group by Western blotting

NUA亞組、HUA亞組、HC組PBMCs ABCG2表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中HUA亞組PBMCs ABCG2表達水平高于NUA亞組，差異有統計學意義（P＜0.05）；HC組PBMCs ABCG2表達水平低于HUA亞組，差異有統計學意義（P＜0.05）；NUA亞組與HC組PBMCs ABCG2表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表6、圖2）。

表6 NUA亞組、HUA亞組、HC組PBMCs ABCG2表達水平比較（±s）Table 6 Expression of ABCG2 protein in PBMCs in NUA subgroup，HUA subgroup and HC group

表6 NUA亞組、HUA亞組、HC組PBMCs ABCG2表達水平比較（±s）Table 6 Expression of ABCG2 protein in PBMCs in NUA subgroup，HUA subgroup and HC group

注：與NUA亞組比較，aP＜0.05；與HUA亞組比較，bP＜0.05

組別 例數 ABCG2 NUA亞組 31 0.43±0.15 HUA亞組 51 0.72±0.26a HC組 46 0.48±0.14b F值 6.319 P值 0.006

圖2 Western blotting 法檢測NUA亞組、HUA亞組、HC組PBMCs ABCG2 表達水平的凝膠電泳圖Figure 2 Gel electrophoresis of expression of ABCG2 protein in PBMCs in NUA subgroup，HUA subgroup and HC group by Western blotting

2.3 ABCG2 mRNA表達水平與血尿酸水平、肌酐水平、Cys-C水平、ESR、hs-CRP水平的相關性分析男性原發性痛風性關節炎患者血尿酸水平、肌酐水平、Cys-C水平、ESR、hs-CRP水平分別為（484.4±130.8）μmol/L、（84.8±20.3）μmol/L、0.8（0.3）mg/L、（21.3±16.6）mm/1 h和 5.6（15.8）mg/L。相關性分析結果顯示，男性原發性痛風性關節炎患者PBMCs ABCG2 mRNA表達水平與血尿酸水平呈正相關（r=0.235，P=0.033），與肌酐水平、Cys-C水平呈負相關（r值分別為-0.227、-0.229，P值分別為0.044、0.043），與ESR、hs-CRP水平無直線相關關系（r值分別為-0.181、0.027，P值分別為0.112、0.824）。

3 討論

20世紀90年代 DOYLE等［8］首次發現 ABCG2，該蛋白由ABCG2基因編碼，定位于4q22.1，基因ID：9429，由655個氨基酸構成，蛋白分子量為72 kDA。ABCG2是一種定位于細胞膜的跨膜轉運蛋白，目前已經發現其在腎臟近端腎小管上皮的頂膜（刷狀緣），小腸、大腸的黏膜上皮細胞、肝細胞等多種組織細胞中均有表達［9-10］。ABCG2已知的功能主要有2種：（1）限制化療藥物［11］、免疫抑制劑［12］、抗病毒藥物［13］向靶向細胞內轉運，導致多藥耐藥；（2）參與生理屏障（血-腦脊液［14］、血-胎盤［15］、血生精小管屏障［16］）保護作用。

近年來研究又證實ABCG2還參與了尿酸的外排轉運，其中WOODWARD等［3］對表達人ABCG2的非洲爪蟾卵母細胞進行尿酸清除率的計算，發現細胞內尿酸鹽含量下降達75%，可見ABCG2的尿酸轉運能力極強，是一種高容量尿酸轉運蛋白。另外HOSOMI等［5］及ICHIDA等［6］的研究也證實ABCG2有轉運尿酸的能力。其中HOSOMI等［5］通過計算高尿酸血癥小鼠模型體內腎臟、腸道和肝臟等部位的尿酸清除效率，發現腎臟及腸道均是尿酸的排泄器官。而ICHIDA等［6］也發現在加入三磷酸腺苷（ATP）的高尿酸血癥模型組小鼠中ABCG2表達水平明顯升高，尿酸排泄能力明顯高于未加入ATP的高尿酸血癥模型組小鼠。

ABCG2表達于全身多個組織器官，但PBMCs中是否同樣有ABCG2表達并參與尿酸轉運尚未發現相關報道。基于以上思路，本課題組選取男性原發性痛風性關節炎患者及健康體檢者進行分析，發現GA組PBMCs ABCG2 mRNA表達水平高于HC組，進一步亞組分析發現，IGA亞組PBMCs ABCG2 mRNA及蛋白表達水平均高于AGA亞組和HC組，而AGA亞組與HC組間的PBMCs ABCG2 mRNA及蛋白表達水平無差異。以上結果首先得出了ABCG2在PBMCs中表達，其次進一步按照炎癥狀態分組（AGA、IGA亞組）并未發現在炎癥狀態最重的急性期（AGA亞組）出現ABCG2高表達，反而是炎性消退的間歇期（IGA）出現了ABCG2高表達。相關性分析結果顯示，患者PBMCs ABCG2 mRNA表達水平與炎癥指標ESR、hs-CRP水平并無直線相關關系。而痛風經典的炎癥過程是單核細胞等炎性細胞在吞噬尿酸鹽晶體后激活Toll樣受體及NOD樣受體介導的免疫炎性信號通路，釋放白介素（IL）-1β等炎性因子而引起的炎癥瀑布反應［17］。ABCG2并不參與這兩條炎性通路中的任何一條，且國內外相關文獻也未見ABCG2參與痛風炎癥的相關報道。綜上，ABCG2可能并不參與痛風的炎癥過程。

尿酸是小分子物質，進入PBMCs內的尿酸如何向外周血中轉運值得探究。為此，本研究將GA組患者按照尿酸水平分為NUA亞組、HUA亞組進行研究。發現HUA亞組PBMCs ABCG2 mRNA及蛋白表達水平高于NUA亞組和HC組，而NUA亞組和HC組間PBMCs ABCG2 mRNA及蛋白表達水平無差異；PBMCs ABCG2 mRNA表達水平與血尿酸水平呈正相關。可見在PBMCs中表達的ABCG2參與了尿酸向外周血轉運的過程，轉運到PBMCs外的尿酸通過血液循環進入腎臟等組織而排出體外。PBMCs ABCG2 mRNA表達水平與肌酐、Cys-C水平呈負相關；提示血尿酸水平可能下調了存在腎功能損害的痛風患者PBMCs ABCG2的表達。推測出現上述情況可能是為了避免腎臟進一步損害，限制PBMCs中表達的ABCG2將尿酸向外周血轉運，達到減輕腎臟負擔的作用。但這個結論目前只是初步推測，還需后期實驗進一步證實。

本研究尚存在一定不足之處，主要是未能同時加入痛風患者關節液進行對比分析，后期實驗可以增加相關內容，并通過基因敲除體外細胞實驗進一步研究ABCG2在PBMCs中的作用機制。而由于PBMCs易在外周血中獲取，如果能通過獲取痛風或高尿酸血癥患者血液而快速檢測包括ABCG2在內的尿酸轉運蛋白的表達是否異常，不僅有利于尋找痛風發生的分子生物學機制，還能為原發性痛風患者的靶向治療提供實驗室。

綜上所述，ABCG2在PBMCs中表達并參與尿酸的轉運，未發現與原發性痛風性關節炎的炎癥過程相關；PBMCs ABCG2 mRNA與肌酐、Cys-C呈負相關，提示存在腎功能異常的痛風患者可能會下調ABCG2在PBMCs中的表達，這可能有利于腎臟的保護，但其具體機制還需進一步研究。