花旗松素對H9C2細胞氧化應激保護作用機制研究

曾志輝，王曉莉，葉艷瓊，王甜甜，蘇其利，詹紀春，申婕，曾茂君，趙明一*

缺血性心臟病（IHD）是全球嚴重的健康問題之一，具有極高的發病率和致死率［1］。在心肌缺血條件下，冠狀動脈供氧與心肌需氧之間的平衡被破壞，導致機體嚴重持續缺氧，最終血管代償失衡并造成不可逆性心肌形態和功能的損害，其中氧化應激（OS）是主要病理改變之一［2］。OS是由于機體遭受嚴重刺激后使體內代謝失常而驟然產生大量活性氧（ROS）［3］，其后氧化作用占據主導位置，通過中性粒細胞炎性浸潤、蛋白酶分泌增加、產生大量氧化毒性中間產物［4］、活化自噬、Ca2+超載、激活內質網應激等機制［5］進一步加重心肌缺氧，從而造成惡性循環，最終導致心肌功能減退而發展為IHD。

花旗松素（Tax）是一種生物黃酮類物質，已有研究表明其因具有降血脂、降血壓等效應，在心血管疾病防治中具有潛在應用價值［6］。但目前關于Tax對受到OS損傷的血管內皮細胞和心肌細胞的保護作用機制尚未明了。有研究表明，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路可通過調節核因子E2相關因子2（Nrf2）/血紅素氧合酶1（HO-1）、B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）等分子活性發揮抗OS作用，另一方面高遷移率族蛋白1（HMGB1）也與OS、炎性反應、自噬等密切相關［7-8］。本文探討Tax對過氧化氫（H2O2）誘導的H9C2細胞OS損傷的保護機制，為OS損傷性疾病的新藥研發提供基礎依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞系 大鼠心肌細胞株H9C2細胞由長沙維爾生物科技有限公司提供。

1.1.2 實驗儀器 蛋白質電泳儀（美國Bio-Rad公司），轉膜儀（美國BD公司），高速離心機（德國艾本德股份公司），凝膠掃描成像系統（上海寶山顧村電光儀器廠），倒置顯微鏡、熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司），紫外分光光度計（上海江儀儀器有限公司），水平瓊脂糖電泳槽（北京六一生物科技有限公司）。

1.1.3 主要實驗試劑 DMEM培養基（美國Gibco公司），胎牛血清（美國ScienCell公司），Tax（上海遠慕生物科技有限公司），Mito-Tracker Green（C1048，美國Molecular Probes公司），蛋白酶抑制劑（德國Merck公司），蛋白磷酸酶抑制劑（瑞士Roche公司），ROS熒光染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），RT-PCR試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司），RT-PCR引物（南京金斯瑞生物科技有限公司），p38抗體（14064-1-AP）、細胞外調節蛋白激酶（ERK）1/2抗體（16443-1-AP）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）抗體（11023-1-AP）（美國proteintech公司），磷酸化p38（p-p38）抗體（9211S，美國CST公司），磷酸化ERK（p-ERK）1/2抗體、磷酸化JNK（p-JNK）抗體（SC-81502）（美國Santa Cruz公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 研究時間 本研究時間為2017年3月—2018年3月。

1.2.2 細胞培養與分組 將H9C2細胞培養于含鏈霉素和氨芐西林雙抗和10%胎牛血清的DMEM培養基中。當細胞培養密度達60%～80%時，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態并對細胞進行傳代處理。將H9C2細胞隨機分為對照組〔僅加入0.1%二甲基亞砜（DMSO）〕、H2O2處理組（加入200 μmol/ml H2O2處理12 h）、Tax+H2O2處理組（加入100 μmol/ml Tax預處理6 h，換液后加入200 μmol/ml H2O2處理12 h）、Tax處理組（加入100 μmol/ml Tax處理6 h）。

1.2.3 光學顯微鏡觀察對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組細胞形態 將對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組的H9C2細胞接種于6孔板中，培養至完全貼壁狀態后，分別進行藥物處理，置于光學顯微鏡下觀察細胞形態。

1.2.4 熒光倒置顯微鏡觀察對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組ROS熒光染色情況 將待測的對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組H9C2細胞接種于6孔板中，培養至完全貼壁狀態后，分別進行藥物處理，加入ROS綠色熒光染色試劑Mito-Tracker Green，避光孵育15 min，熒光倒置顯微鏡下觀察細胞染色情況并拍照。

1.2.5 RT-PCR法檢測對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、骨橋蛋白（OPN）、HMGB1 mRNA表達水平 用Trizol法提取各組H9C2細胞的mRNA，按照RT-PCR試劑盒說明書操作，將其反轉錄成cDNA并作為模板，檢測各組細胞中iNOS、OPN、HMGB1 mRNA表達水平，RT-PCR引物序列見表1。以β-actin引物序列作為內參校正樣品Ct值，實驗獨立重復3次。

1.2.6 Western blotting法檢測對照組、Tax處理組MAPK 信 號 通 路 p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK表達水平 按照Western blotting實驗操作流程，收集對照組及Tax處理組待測細胞，加入RIPA裂解、定量后取20 μl上樣進行凝膠電泳。電泳結束后轉膜60～70 min，用清蛋白在室溫下封閉30 min后加入一抗（p38抗體、JNK抗體、ERK1/2抗體）（1∶500稀釋），4 ℃搖床孵育過夜，室溫下加二抗（p-p38抗體、p-JNK抗體、p-ERK1/2抗體）（1∶2 000稀釋），孵育2 h后加入ECL化學發光液，在凝膠成像系統中觀察、拍照，采用Image J軟件對電泳條帶進行灰度分析，記錄 p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK 表達水平。實驗獨立重復3次。

1.3 統計學方法 使用GraphPad Prism 5.0軟件對數據進行分析。計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組細胞形態對照組細胞為正常梭形（見圖1A），與對照組相比，H2O2處理組細胞出現肥大，呈圓形及不規則形狀（見圖1B），而Tax+H2O2處理組細胞形態接近梭形，細胞變圓及肥大程度較H2O2處理組輕，不規則形態細胞數量減少（見圖1C）。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Primers sequences used for RT-PCR analysis

圖1 對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組細胞形態（×200）Figure 1 H9C2 cell cellular morphology of the control group，H2O2 treatment group and Tax+H2O2 treatment group

2.2 對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組ROS熒光染色情況 對照組綠色熒光極少且亮度較弱（見圖2A），H2O2處理組綠色熒光量較對照組明顯增多且亮度增強（見圖2B），而Tax+H2O2處理組較H2O2處理組綠色熒光量及亮度減弱（見圖2C）。

圖2 對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組ROS熒光染色情況（ROS熒光染色，×200）Figure 2 H9C2 cell ROS fluorescent staining pictures of the control group，H2O2 treatment group and Tax+H2O2 treatment group

2.3 對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組iNOS、OPN、HMGB1 mRNA表達水平比較 對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組iNOS、OPN、HMGB1 mRNA表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；Tax+H2O2處理組iNOS mRNA表達水平低于H2O2處理組，差異有統計學意義（P＜0.05）；Tax+H2O2處理組OPN mRNA表達水平低于對照組、H2O2處理組，差異有統計學意義（P＜0.05）；Tax+H2O2處理組HMGB1 mRNA表達水平高于對照組、H2O2處理組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

表2 對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組iNOS、OPN、HMGB1 mRNA表達水平比較（±s，n=3）Table 2 The mRNA expression of iNOS，OPN，HMGB1 of the control group，H2O2 treatment group and Tax+H2O2 treatment group

表2 對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組iNOS、OPN、HMGB1 mRNA表達水平比較（±s，n=3）Table 2 The mRNA expression of iNOS，OPN，HMGB1 of the control group，H2O2 treatment group and Tax+H2O2 treatment group

注：H2O2=過氧化氫，Tax=花旗松素；與對照組比較，aP＜0.05；與H2O2處理組比較，bP＜0.05

組別 iNOS mRNA OPN mRNA HMGB1 mRNA對照組 1.182±0.694 1.054±0.398 1.028±0.287 H2O2處理組 2.098±0.281 1.439±0.198 1.259±0.219 Tax+H2O2處理組 0.690±0.038b 0.341±0.031ab 1.951±0.084ab F值 8.175 14.110 15.100 P值 0.019 0.005 0.005

2.4 對照組、Tax處理組MAPK信號通路p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK表 達 水 平 比 較Tax處理組MAPK信號通路p38表達水平低于對照組，p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK表達水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，見圖3、表3）。

圖3 Western blotting法檢測MAPK信號通路p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK表達水平的凝膠電泳圖Figure 3 Gel electrophoresis picture of p38，p-p38，ERK1/2，p-ERK1/2，JNK，p-JNK of MAPK signaling pathway detected by Western blotting

表3 對照組、Tax處理組MAPK信號通路p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK表達水平比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of expression of p38，p-p38，ERK1/2，p-ERK1/2，JNK，p-JNK of MAPK signaling pathway between control group and Tax treatment group

表3 對照組、Tax處理組MAPK信號通路p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK表達水平比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of expression of p38，p-p38，ERK1/2，p-ERK1/2，JNK，p-JNK of MAPK signaling pathway between control group and Tax treatment group

注：p-p38=磷酸化p38，ERK=細胞外調節蛋白激酶，p-ERK=磷酸化ERK，JNK=c-Jun氨基末端激酶，p-JNK=磷酸化JNK

組別 p38 p-p38 ERK1/2 p-ERK1/2 JNK p-JNK對照組 74.04±0.53 4.98±0.01 54.48±0.27 26.94±0.25 55.60±1.22 16.86±0.14 Tax處理組 63.69±1.33 103.10±4.23 65.49±0.14 65.29±1.53 62.44±0.50 40.68±0.45 t值 7.235 23.190 35.910 24.710 5.193 50.330 P值 0.002 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.007 ＜0.001

3 討論

后基因組時代IHD仍然是備受全球關注的健康問題［9］。在生命氧化代謝活動過程中，機體不斷產生各種氧自由基（OFR）。在生理狀態下，體內抗氧化防御體系可以清除體內產生的少量OFR，而體內的OFR過度產生或清除減少，造成ROS生成與抗氧化防御之間的平衡紊亂，即OS。OS可導致脂質過氧化，損傷細胞結構，破壞細胞膜，可致核酸堿基修飾及核酸鏈斷裂，染色體破壞，引起細胞功能障礙。心肌缺血缺氧時，線粒體單電子還原增多、中性粒細胞呼吸爆發等生理病理改變，造成OFR大量增多，ROS在心肌細胞中大量蓄積，促進OS，而OS可通過損傷細胞膜，促進細胞凋亡、Ca2+超載，產生炎性遞質，損傷血管內皮細胞等機制造成心肌細胞損害，心功能受損，導致IHD的發生。Tax是一種黃酮類中草藥，相關研究表明其在心肌細胞中可抑制OS所致線粒體凋亡，同時可抑制還原型輔酶Ⅱ（NADPH）氧化酶產生ROS，抗OS，發揮心肌保護作用，對H2O2誘導的細胞凋亡具有保護作用［10］。

為了探討Tax對H2O2誘導的大鼠心肌細胞株H9C2細胞OS損傷是否具有保護作用，本實驗將H9C2細胞分為對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組，通過觀察各組細胞形態、ROS熒光染色情況及iNOS、OPN、HMGB1 mRNA表達水平，驗證Tax對H2O2誘導的H9C2細胞OS的影響。結果顯示，與對照組細胞相比，H2O2處理后細胞形態變圓，出現肥大，同時ROS染色綠色熒光較對照組明顯增多且亮度增強，提示細胞內的ROS水平明顯升高，表明H2O2處理H9C2細胞可以模擬OS表型；而Tax+H2O2處理組經Tax預處理后細胞形態接近梭形，細胞變圓及肥大程度較H2O2處理組輕，不規則形態細胞數量減少，細胞形態得到改善，綠色熒光量及強度介于對照組和H2O2處理組之間，提示ROS水平明顯降低，Tax可以改善H2O2對細胞造成的形態學改變，并減少細胞內OS水平。Tax預處理能減輕、逆轉H2O2所致的心肌細胞損傷，改善OS所導致的心肌細胞損傷。

iNOS是非鈣依賴性酶，在正常狀態無表達，缺血、缺氧等可激活誘導iNOS mRNA的表達，持續翻譯合成iNOS，催化NO大量持續產生，iNOS催化生成的NO可發生快速氧反應生成OFR，加重心肌細胞的損傷［11］。OPN是一種主要由巨噬細胞分泌的磷酸化糖蛋白，隸屬于近來被稱之為“細胞蛋白”的一組秘密大分子［12］。心臟中，OPN是一種新近發現的黏蛋白，在出現炎癥、損傷或應激反應時其分泌增加。OPN的異常表達參與了部分心血管疾病的病理進程，OPN表達水平升高可引起T淋巴細胞的增殖活化并介導其趨化遷移，造成嚴重的心肌損傷，導致心功能衰竭［13］。HMGB1是一種高度保守的蛋白質，可由壞死細胞和凋亡細胞被動釋放，在細胞內外均可以發揮生物作用［14］。在細胞核內，HMGB1作為一種非組蛋白染色體結合蛋白參與包括轉錄、DNA修復、細胞分化和發育多種生物過程［15］；在細胞質內，HMGB1能介導吞噬作用；在細胞外，HMGB1則作為損傷相關分子模式（DAMP）發揮作用，是最具特征性的DAMP分子［16］，能與其他細胞因子、趨化因子及病原相關性分子模式相互作用，參與適應性免疫應答、組織重構、血管再生、促進平滑肌細胞遷移及增殖以及介導內皮細胞遷移活化［17-19］。本研究結果顯示，Tax+H2O2處理組iNOS mRNA表達水平低于H2O2處理組，OPN mRNA表達水平低于對照組、H2O2處理組，HMGB1 mRNA表達水平高于對照組、H2O2處理組，表明Tax可以激活HMGB1表達，抑制OS相關基因iNOS、OPN的表達，提示Tax可通過激活HMGB1表達，抑制OS相關基因iNOS、OPN的表達，促進心肌細胞修復OS損傷。

MAPK信號通路是將信號從細胞表面傳導到細胞核內的一種重要信號傳導系統，包括ERK1/2、JNK/應激激活蛋白激酶（SAPK）、p38及ERK5/大絲裂原活化蛋白激酶1（BMK1）4條途徑，這些途徑通過不同的細胞外信號傳導刺激上游激酶的磷酸化而被激活［20］。MAPK級聯激活是多種信號通路的中心，在許多細胞增殖相關信號通路中具有關鍵作用。已有研究表明，MAPK信號通路的激活可誘導下游分子的表達，發揮抗OS、促自噬、促凋亡等作用［21］。為進一步探明Tax對抗OS的機制，本研究檢測了對照組、Tax處理組MAPK信號通路相關蛋白及其磷酸化蛋白表達水平，結果顯示，Tax處理組MAPK信號通路p38表達水平低于對照組，p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK表達水平高于對照組，表明Tax可提高細胞內MAPK信號通路蛋白的磷酸化水平，提示Tax可能通過激活MAPK信號通路，激活HMGB1表達，抑制OS相關基因iNOS、OPN的表達，發揮抗OS作用。

綜上所述，Tax可以改善H2O2對細胞造成的形態學改變并減少細胞內OS水平，其機制可能通過激活MAPK信號通路，激活HMGB1表達，抑制OS相關基因iNOS、OPN的表達來發揮抗OS作用。