黑果枸杞原花青素對(duì)小鼠皮膚衰老模型的保護(hù)作用研究

馬嘉藝，郭硯，冶娟，馬文宇

隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，人類的平均壽命不斷增長(zhǎng)，皮膚衰老問(wèn)題得到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。皮膚衰老是一種不可避免的生理變化過(guò)程，隨著年齡增長(zhǎng)，皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞數(shù)量減少及功能下降，彈性蛋白和膠原蛋白合成減少及萎縮，皮膚變得缺乏彈性、松弛、粗糙，并伴有不規(guī)則色素沉著、皺紋等［1］。與此同時(shí)，人們對(duì)自然來(lái)源的抗氧化劑的需求也越來(lái)越多。黑果枸杞為茄科枸杞屬多年生灌木，是一種獨(dú)特的藥食兩用植物，在藏藥中稱為“旁瑪”［2］。研究證實(shí)，黑果枸杞果實(shí)中含有大量花色苷、原花青素、多糖、黃酮等生理活性成分，具有抗氧化、抗疲勞、延緩衰老、降血糖、降血脂、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、增強(qiáng)免疫功能等作用［3］。分光光度法測(cè)得黑果枸杞的原花青素含量為16 μg/g，是藍(lán)莓的18倍［4］。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)黑果枸杞的研究多集中于其常見(jiàn)生理活性成分的提取、純化、結(jié)構(gòu)分析及含量測(cè)定，尚未見(jiàn)對(duì)青海黑果枸杞原花青素抗衰老作用的研究。本文旨在從小鼠背部皮膚模型真皮層厚度、膠原纖維、彈力纖維及基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9方面研究黑果枸杞原花青素對(duì)小鼠皮膚衰老模型的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 青海黑果枸杞原花青素粉末購(gòu)自西安萬(wàn)方生物科技有限公司；維生素E滴劑及D-半乳糖粉末購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；長(zhǎng)波黑斑效應(yīng)紫外線（UVA）+中波紅斑效應(yīng)紫外線（UVB）紫外線光療儀購(gòu)自南京卡知電子科技有限公司；UVB和UVA型UV輻照度監(jiān)視器購(gòu)自臺(tái)灣路昌電子企業(yè)公司；HE染色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；Weigert彈力纖維染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；IX71型Olympus倒置顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司；Trizol RNA提取液購(gòu)自ambion公司；小鼠MMP-2、MMP-9、內(nèi)參β-actin的PCR引物購(gòu)自華大基因公司；RT-PCR試劑盒及SYBR Green I嵌合熒光定量PCR 擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 動(dòng)物分組 2016年10月—2017年12月，選取45日齡SPF級(jí)昆明種雌性小鼠50只，體質(zhì)量18～22 g，由西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組（A組）、皮膚衰老模型組（B組）、皮膚衰老模型+維生素E滴劑組（C組）、皮膚衰老模型+低劑量黑果枸杞原花青素（D組）、皮膚衰老模型+高劑量黑果枸杞原花青素（E組），每組10只。

1.3 造模、給藥方法

1.3.1 造模 A組小鼠正常光照飼養(yǎng)。B組、C組、D組、E組小鼠采用4%硫酸鈉脫毛，脫毛區(qū)域?yàn)楸巢科つw5 cm×5 cm，間隔10 d脫毛1次，每日頸背部皮下注射5% D-半乳糖10 ml/kg。B組、C組、D組、E組采用UVA+UVB紫外線光療儀于距小鼠約40 cm垂直高處照射，功率均40 W，隔日照射，照射前燈管預(yù)熱15 min，每次照射40 min，持續(xù)造模40 d（UVA總劑量89.4 J/cm2，UVB總劑量8.3 J/cm2）。造模成功的宏觀體貌的觀察指標(biāo)為肉眼觀察B組、C組、D組、E組較A組小鼠背部皮膚光滑程度減低，皺紋增多等。

1.3.2 給藥方法 造模第11天，A組、B組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃0.5 ml/d，C組給予維生素E滴劑灌胃0.5 ml/d，D組、E組給予黑果枸杞原花青素灌胃，劑量分別為50 mg·kg-1·d-1和 100 mg·kg-1·d-1，連續(xù)用藥 30 d。

1.4 取材 造模第42天，5組小鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，快速剪取頸背部4 cm×4 cm大小的脫毛皮膚，仔細(xì)除去皮下多余脂肪，部分皮膚小心攤平后，放入10%甲醛溶液中固定用于病理組織學(xué)檢測(cè)，余皮膚冷凍于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 Weigert彈力纖維染色 標(biāo)本于10%甲醛溶液中固定12 h后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，進(jìn)行Weigert彈力纖維染色。在光鏡（×40）下觀察各組標(biāo)本真皮層厚度變化，在光鏡（×400）下觀察各組標(biāo)本真皮層膠原纖維、彈力纖維的變化。

1.5.2 RT-PCR法測(cè)定MMP-2、MMP-9的mRNA表達(dá)水平 取保存在-80 ℃冰箱中的皮膚組織50 mg，提取樣本皮膚組織的總RNA，測(cè)定濃度并定量后采用RT-PCR試劑盒完成反轉(zhuǎn)錄。取反轉(zhuǎn)錄后cDNA使用SYBR Green I嵌合熒光法進(jìn)行PCR檢測(cè)。引物設(shè)計(jì)：內(nèi)參β-actin上游引物為5'-GAGTACAACCTTCTTGCAGCTC-3'，下游引物為5'-CATACCCACCATCACACCCTG-3'， 擴(kuò) 增 長(zhǎng) 度 198 bp；MMP-2上游引物為5'-TGGCACCACCGAGGACTATGAC-3'，下游引物為5'-ACACCACACCTTGCCATCGTTG-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度175 bp；MMP-9上游引物為5'-TGATTGACGACGCCTTTGCC-3'，下游引物為5'-CCGCGACACCAAACTGGATG-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度114 bp。采用2-ΔΔCt法計(jì)算MMP-2、MMP-9的mRNA表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Weigert彈力纖維染色 光鏡（×40）下，肉眼可見(jiàn)B組較A組真皮層厚度明顯減小，C組、D組、E組較A組真皮層厚度稍增厚（見(jiàn)圖1）。光鏡（×400）下，肉眼可見(jiàn)B組較A組真皮層膠原纖維及彈力纖維缺失、排列紊亂、結(jié)構(gòu)松散，出現(xiàn)斷裂、卷曲，證明本次小鼠皮膚衰老模型造模成功；C組較B組可見(jiàn)纖維組織增多、網(wǎng)狀排列，仍可見(jiàn)斷裂、卷曲；D組、E組較B組、C組明顯可見(jiàn)新生纖維組織、排列整齊，斷裂、卷曲明顯減少，且E組較D組新生纖維更成熟（見(jiàn)圖2）。

2.2 MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表 達(dá) 水 平 5組 小 鼠MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。B組小鼠MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表達(dá)水平高于A組，D組、E組小鼠MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表達(dá)水平均低于B組，E組小鼠MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表達(dá)水平低于D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表1）。

表1 5組小鼠MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表達(dá)水平比較（±s）Table 1 Comparison of expression levels of MMP-2 mRNA and MMP-9 mRNA in 5 groups

表1 5組小鼠MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表達(dá)水平比較（±s）Table 1 Comparison of expression levels of MMP-2 mRNA and MMP-9 mRNA in 5 groups

注：與A組比較，aP＜0.05；與B組比較，bP＜0.05；與D組比較，cP＜0.05

組別 只數(shù) MMP-2 mRNA MMP-9 mRNA A組 10 0.56±0.10 0.42±0.11 B組 10 1.00±0.00a 1.00±0.00a C組 10 0.95±0.13 0.94±0.07 D組 10 0.76±0.08b 0.74±0.08b E組 10 0.52±0.06bc 0.48±0.12bc F值 13.703 17.697 P值 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

皮膚衰老通常分為內(nèi)源性衰老和外源性老化。內(nèi)源性衰老又稱為時(shí)程性老化或自然衰老，是具有年齡依賴性的皮膚功能和結(jié)構(gòu)的老化。外源性老化又稱為皮膚光老化，紫外線照射是其最主要因素，其特征更主要在于膠原、彈性纖維的損傷及異常彈性纖維的沉積等［5］。青海所在的青藏高原地區(qū)具有高海拔、缺氧、強(qiáng)紫外線的環(huán)境特點(diǎn)，長(zhǎng)期居住于此的人群更易加速皮膚衰老，引發(fā)多種皮膚疾病。尤其高原地區(qū)強(qiáng)紫外線輻射對(duì)皮膚造成曬傷、炎癥、抵抗力下降、氧化應(yīng)激、過(guò)早衰老、癌癥等傷害［6］。但與此同時(shí)，青海地區(qū)因其獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境孕育著其特有的植被資源。從天然植物中尋找高效、無(wú)害的天然抗老化成分已日漸成為學(xué)者們的研究熱點(diǎn)。原花青素被認(rèn)為是有效的抗氧化劑，其營(yíng)養(yǎng)及生物活性價(jià)值已得到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛認(rèn)可［7］。但目前，青海黑果枸杞原花青素對(duì)皮膚衰老的影響機(jī)制不詳。

圖1 Weigert彈力纖維染色顯示各組小鼠皮膚真皮層厚度的變化（Weigert彈力纖維染色，×40）Figure 1 Weigert elastic fiber staining showed changes in dermal thickness of mice skin in each group圖2 Weigert彈力纖維染色顯示各組小鼠皮膚真皮層纖維組織的變化（Weigert彈力纖維染色，×400）Figure 2 Weigert elastic fiber staining showed the changes of dermal fibrous tissues of mice in each group

本實(shí)驗(yàn)小鼠皮膚衰老模型的建立通過(guò)采用D-半乳糖皮下注射聯(lián)合紫外線UVA、UVB照射，最大限度地模擬皮膚衰老過(guò)程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，B組較A組明顯可見(jiàn)皮膚真皮層厚度減小，膠原纖維及彈性纖維缺失、排列紊亂、結(jié)構(gòu)松散、斷裂、卷曲等皮膚衰老現(xiàn)象，故實(shí)驗(yàn)造模有效。Weigert彈力纖維染色可見(jiàn)，經(jīng)維生素E滴劑治療后，真、表皮層變化不明顯，而50 mg·kg-1·d-1和100 mg·kg-1·d-1黑果枸杞原花青素均可減少皮膚真皮纖維變性、缺失，增加真皮層厚度，后者改變程度大于前者，證實(shí)黑果枸杞原花青素對(duì)于真皮層厚度、膠原纖維及彈性纖維再生的療效。

膠原蛋白及彈性蛋白是存在于細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中維持皮膚彈性和強(qiáng)度的主要物質(zhì)［8］。而MMP是一組廣泛存在的Zn2+依賴性內(nèi)肽酶，MMPs 能降解絕大部分ECM成分，包括膠原蛋白和彈性蛋白，對(duì)ECM成分的動(dòng)態(tài)重塑起著重要的作用［6，9-10］。同時(shí)，MMP被認(rèn)為是光老化的參與因子，即使極低的紫外線輻射水平也能上調(diào)人體皮膚中的MMP活性［5］。因此，抑制劑直接抑制MMP的活性或通過(guò)減少M(fèi)MP的表達(dá)來(lái)間接抑制可能是抵抗皮膚衰老的有效方法。MMP根據(jù)作用底物及結(jié)構(gòu)的不同分為五大類：膠原酶、明膠酶、基質(zhì)溶解素、膜型MMP、其他類型MMP［6］。其中，MMP-2及MMP-9均屬于明膠酶，通過(guò)降解ECM如變性膠原、基底膜結(jié)構(gòu)等來(lái)影響皮膚表、真皮層導(dǎo)致皮膚老化［11-12］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，B組小鼠MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表達(dá)水平高于A組，表明本實(shí)驗(yàn)的小鼠皮膚衰老模型中存在MMP的過(guò)度表達(dá)，造成細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度降解，從而導(dǎo)致皮膚衰老。D組、E組小鼠MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表達(dá)水平均低于B組，E組小鼠MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表達(dá)水平低于D組，進(jìn)一步證實(shí)了療效同藥物有關(guān)，表明黑果枸杞原花青素可以通過(guò)較少M(fèi)MP-2、MMP-9的過(guò)度表達(dá)來(lái)減少細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度降解，從而發(fā)揮抵抗皮膚衰老的效果。

綜上所述，黑果枸杞原花青素是通過(guò)影響皮膚真皮層厚度、纖維形態(tài)及MMP-2、MMP-9水平起到治療皮膚衰老的作用，從而證實(shí)青海黑果枸杞原花青素改善皮膚衰老的潛能，為青海黑果枸杞的開(kāi)發(fā)、利用提供理論依據(jù)。