性類固醇激素在蝦夷扇貝性腺發(fā)育周期的分布?

謝欣冉， 張玲玲，2??， 孫紅振， 張 陽(yáng)， 李婉茹， 張美溦， 包振民，2

(1．中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003;2．海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237)

類固醇(Steroids)是一種含有甾核的化合物，是以膽固醇(Cholesterol)為前體經(jīng)過(guò)一系列酶促反應(yīng)合成而來(lái)，一般作為激素在生物性別分化、生殖、發(fā)育以及內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持等多種生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]。在脊椎動(dòng)物中，與生殖調(diào)控相關(guān)的性類固醇激素主要包括孕酮、睪酮和雌二醇。已有研究顯示，這三種激素在軟體動(dòng)物中也存在[2-3]，而且軟體動(dòng)物性腺中性類固醇激素含量會(huì)隨生殖周期發(fā)生季節(jié)性變化[4-5]。因此，性類固醇激素很可能參與軟體動(dòng)物的生殖調(diào)控。

蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)是一種沿日本北部海岸線，朝鮮半島北部和俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)自然分布的雙殼貝類。由于其具有較高的商業(yè)價(jià)值，自1982年從日本引進(jìn)以來(lái)，蝦夷扇貝已成為中國(guó)北方地區(qū)最重要的海水養(yǎng)殖貝類之一[6]。由于蝦夷扇貝在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的重要性，對(duì)其性腺發(fā)育、繁殖規(guī)律的研究起步較早[7-8]，已有研究者在蝦夷扇貝性腺中檢測(cè)到了雌激素，以及脊椎動(dòng)物激素合成通路基因的活性[9-10]。但迄今為止，尚缺乏對(duì)蝦夷扇貝性腺發(fā)育周期中多種性類固醇激素含量的系統(tǒng)研究。本文分析了蝦夷扇貝性腺4個(gè)發(fā)育階段中3種常見(jiàn)性類固醇激素(孕酮、睪酮和雌二醇)含量及相對(duì)比例的變化，為研究性類固醇激素在軟體動(dòng)物生殖、發(fā)育過(guò)程中的作用提供了參考。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用二齡蝦夷扇貝均取自山東省萊州市海益養(yǎng)殖廠。樣品從2015年8月采集至次年7月，每次取樣約100只。將采集的蝦夷扇貝運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室置于過(guò)濾海水中暫養(yǎng)24 h，每次挑選40個(gè)活力良好的個(gè)體(雌雄各20個(gè))，將性腺剪為2部分，一部分用4%多聚甲醛固定24 h，后經(jīng)換液保存于100%甲醇中，用于石蠟切片統(tǒng)計(jì)性腺發(fā)育時(shí)期的周年分布頻率；剩余的性腺組織去除消化管后液氮快速冷凍，然后保存于-80 ℃，用于激素測(cè)定。

1.2 組織學(xué)觀察

將多聚甲醛固定后的性腺樣品從甲醇中取出，進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，并使用蘇木精-伊紅(HE)進(jìn)行染色。簡(jiǎn)要流程如下：使用梯度乙醇脫水(70%、85%、95%乙醇3 min，無(wú)水乙醇5 min，2次)，二甲苯透明(15 min，2次)，石蠟包埋，石蠟切片(切片厚度為5 μm)，切片完全展開(kāi)后貼于載玻片上，在烤片機(jī)中烘干(37 ℃，3 h以上)；使用二甲苯將切片脫蠟，梯度乙醇復(fù)水(100%、90%、85%、70%、50%、30%乙醇各3 min)，使用蘇木精染液染色5～10 min，自來(lái)水沖洗掉多余染液，酸水(0.5% HCl 溶液)分色，自來(lái)水沖洗 20～30 min復(fù)藍(lán)；然后使用梯度乙醇脫水(30%、50%、70%、85%、95%乙醇各3 min)，在伊紅染液(1%伊紅溶于95%乙醇溶液)中染色10～15 s，95%乙醇洗去多余染液，無(wú)水乙醇脫水(5 min, 2次)，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片；使用顯微鏡觀察切片并拍照。

1.3 性類固醇激素水平檢測(cè)

1.3.1 性類固醇激素的提取 每個(gè)性腺發(fā)育時(shí)期選取6個(gè)樣品(精巢、卵巢各3個(gè))，采用二氯甲烷液液萃取法進(jìn)行激素提取。取0.1 g性腺組織，用預(yù)冷的0.5 mL超純水勻漿2次，每次2 min；使用超聲波細(xì)胞破碎儀將組織勻漿破碎(200 w，超聲10 s，暫停5 s，共3 min)；加入400 μL預(yù)熱的25 mmol/L的HCl，渦旋2 min并于40 ℃水浴孵育15 min；孵育結(jié)束后，加入1.25 mL 0.07 mol/L的Na2HPO4，向勻漿液中加入14 mL二氯甲烷，渦旋2 min后將勻漿液于3 000g離心10 min，使水與有機(jī)相分離；使用巴斯德管將下層有機(jī)相轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中；向殘留有上層無(wú)機(jī)相的離心管中再次加入14 mL二氯甲烷并渦旋2 min，之后3 000g離心10 min，使用巴斯德管將下層有機(jī)相轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中；使用氮吹儀在室溫將有機(jī)相中二氯甲烷吹干獲得的固態(tài)殘留物使用500 μL ELISA試劑盒中的EIA buffer溶解。

1.3.2 性腺性類固醇激素水平的測(cè)定 使用Cayman公司的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒測(cè)定卵巢和精巢中孕酮、睪酮和雌二醇的濃度，流程參照Cayman ELISA試劑盒中的說(shuō)明書(shū)。每個(gè)樣品設(shè)2個(gè)技術(shù)重復(fù)，使用Cayman公司提供的ELISA Double表格計(jì)算樣品中的激素濃度。類固醇含量定義為每克性腺濕重的類固醇量(ng/g)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

蝦夷扇貝不同時(shí)期性腺激素的差異顯著性采用單因素方差分析法(one-way ANOVA)分析；同一時(shí)期卵巢和精巢中性類固醇激素的差異顯著性使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析；3種激素含量之間的關(guān)系通過(guò)Pearson相關(guān)分析法獲得。顯著性水平均設(shè)定為P<0.05。以上分析均使用SPSS 21.0軟件計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 性腺發(fā)育的周年分布

本研究通過(guò)組織學(xué)方法分析蝦夷扇貝性腺4個(gè)主要發(fā)育階段(休止期、增殖期、生長(zhǎng)期、成熟期)的周年分布，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖1。休止期主要分布在7—9月，增殖期分布在10—12月，生長(zhǎng)期主要分布在1—2月，成熟期主要分布在1—6月。有些月份性腺發(fā)育同步，比如8—9月份的精巢和卵巢均處于休止期，而3—5月份的精巢和卵巢都處于成熟期。相比之下，有些月份的性腺發(fā)育同步性差，在10和12月份的樣品中尤為突出：這2個(gè)月份的精巢均同時(shí)出現(xiàn)了休止期、增殖期和生長(zhǎng)期，10月份的卵巢也同時(shí)出現(xiàn)了上述3個(gè)時(shí)期，而12月份的卵巢則涵蓋了休止期、增殖期、生長(zhǎng)期和成熟期4個(gè)發(fā)育時(shí)期。

(A.精巢；B. 卵巢。A . Testis; B. Ovary.)圖1 蝦夷扇貝性腺發(fā)育的周年分布Fig.1 Annual distribution of gonadal developmental stages inPatinopecten yessoensis

2.2 性類固醇激素含量分析

如圖2A所示，在蝦夷扇貝性腺4個(gè)發(fā)育階段，精巢和卵巢中孕酮含量的變化范圍分別是(3.86±0.64)～ (6.24±1.51) 和(3.47±0.32 )～ (6.52±1.08) ng/g。無(wú)論是精巢還是卵巢，休止期的孕酮含量都高于其它3個(gè)時(shí)期。比較各發(fā)育時(shí)期的精巢和卵巢之間的差異，發(fā)現(xiàn)孕酮含量在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中均無(wú)顯著差異。

在性腺4個(gè)發(fā)育時(shí)期中，精巢的睪酮含量范圍是(0.72±0.21)～ (1.01±0.37) ng/g，卵巢的睪酮含量范圍是(0.64±0.10)～ (0.99±0.12) ng/g(見(jiàn)圖2B)。雖然睪酮的含量在各發(fā)育時(shí)期的精巢和卵巢之間并無(wú)顯著差異，但除休止期以外，精巢中睪酮的含量都高于卵巢。

蝦夷扇貝精巢中雌二醇含量范圍是(1.90±0.26)～(2.37±0.88)ng/g，卵巢中的含量范圍是(2.43±0.59)～ (2.71±0.30) ng/g(見(jiàn)圖2C)。盡管精巢和卵巢之間雌二醇的含量差異在性腺各發(fā)育時(shí)期均不顯著，但卵巢中雌二醇的含量始終高于精巢。

統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品中三種激素的總含量，結(jié)果如圖2D所示。精巢和卵巢中激素總含量的變化范圍分別是(6.69±0.94)～ (9.19±2.21)和(6.78±1.00)～ (10.21±0.66) ng/g，精巢和卵巢之間3種激素的總含量在增殖期差異最小，在休止期、生長(zhǎng)期和成熟期雖有差異但并不顯著。

圖2 性類固醇激素在蝦夷扇貝性腺4個(gè)發(fā)育時(shí)期的含量所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤 (n=3)Fig. 2 Sex steroids concentrations in the four gonadal developmental stages ofPatinopecten yessoensiseach value is represented as a mean±SEM (n=3)

分析蝦夷扇貝精巢和卵巢中3種激素含量的相關(guān)性，結(jié)果如表1所示。在精巢中，3種激素間均呈顯著正相關(guān)(P<0.01)；而在卵巢中，僅孕酮與睪酮含量呈顯著正相關(guān)(P<0.01)，雌二醇與其它2種激素含量的相關(guān)性并不顯著。

表1 蝦夷扇貝精巢和卵巢中三種性類固醇激素之間的相關(guān)性Table 1 Correlation between the three sex steroids in the testis and ovary ofPatinopecten yessoensis

注：**表示Pearson相關(guān)系數(shù)顯著性<0.01。

Note：**indicates the significance of Pearson correlation coefficient was<0.01.

2.3 3種激素占比隨性腺發(fā)育的變化

分析孕酮、睪酮、雌二醇相對(duì)于激素總含量的百分比(見(jiàn)圖3)，結(jié)果顯示，以上三種激素分別約占激素總含量的60%、10%、30%。除生長(zhǎng)期外，精巢中孕酮的比例均略高于卵巢(見(jiàn)圖3A)。睪酮比例在生長(zhǎng)期精巢和卵巢之間差異顯著(P<0.05)，精巢高于卵巢，但在休止期、增殖期和成熟期中差異并不明顯(見(jiàn)圖3B)。雖然在4個(gè)性腺發(fā)育階段中，雌二醇的比例在精巢和卵巢之間均不顯著，但各時(shí)期卵巢中雌二醇所占比例均高于精巢(見(jiàn)圖3C)。

2.4 激素相對(duì)比值的變化情況

本文進(jìn)一步探究了精巢和卵巢中3種激素兩兩比值(睪酮/孕酮、雌二醇/睪酮和雌二醇/孕酮)隨性腺發(fā)育過(guò)程的變化，結(jié)果如圖4所示。精巢和卵巢中睪酮/孕酮變化范圍分別是(0.12±0.02)～(0.24±0.02)和(0.14±0.03)～(0.19±0.01)。雖然精巢和卵巢中睪酮/孕酮在性腺4個(gè)發(fā)育時(shí)期差異都不顯著，但可以看出，除休止期外，精巢中睪酮/孕酮都高于卵巢，生長(zhǎng)期精巢和卵巢的睪酮/孕酮差異最大(見(jiàn)圖4A)。

雌二醇/睪酮在精巢4個(gè)發(fā)育時(shí)期的變化范圍是(2.08±0.23)～(3.19±0.41)，在卵巢中的變化范圍是(2.74±0.03)～(4.31±1.57)。卵巢中雌二醇/睪酮在增殖期、生長(zhǎng)期和成熟期都高于精巢，在生長(zhǎng)期二者差異顯著(P<0.05)(見(jiàn)圖4B)。

圖3 性類固醇激素所占比例在蝦夷扇貝性腺4個(gè)發(fā)育時(shí)期的變化
Fig.3 Variations of the percentage of three sex steroids in the four gonadal developmental stages ofPatinopectenyessoensis

雌二醇/孕酮在精巢和卵巢各發(fā)育階段中的變化范圍分別是(0.36±0.03)～(0.49±0.09)和(0.42±0.09)～(0.77±0.26)。雖然在性腺發(fā)育4個(gè)時(shí)期中，雌二醇/孕酮在精巢和卵巢之間差異均不顯著，但卵巢中雌二醇/孕酮始終高于精巢，成熟期差異最大(見(jiàn)圖4C)。

3 討論

3.1 性腺發(fā)育階段分布頻率

本研究分析了山東萊州蝦夷扇貝性腺四個(gè)主要發(fā)育階段的周年分布：休止期(7—9月)、增殖期(10—12月)、生長(zhǎng)期(1—2月)、成熟期(1—6月)。這與李文姬等對(duì)大連獐子島蝦夷扇貝性腺周年變化規(guī)律的分析結(jié)果基本一致[11]。在櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)中，性腺各發(fā)育階段的分布為：增殖期(1—3月)、生長(zhǎng)期(4月)、成熟期(5—9月)、生殖期(5—10月)和休止期(11—12月)[12]。相比櫛孔扇貝，蝦夷扇貝的性腺發(fā)育要早一些，這可能跟蝦夷扇貝的最適生長(zhǎng)溫度低于櫛孔扇貝有關(guān)。

圖4 睪酮/孕酮、雌二醇/睪酮和雌二醇/孕酮比值在蝦夷扇貝性腺4個(gè)發(fā)育時(shí)期的水平
Fig.4 The levels of testosterone/progesterone, estradiol/testosterone and estradiol / progesterone in the four gonadal developmental stages ofPatinopectenyessoensis

研究發(fā)現(xiàn)蝦夷扇貝在同一月份出現(xiàn)性腺發(fā)育不同步的現(xiàn)象。6—7月的精巢和卵巢都同時(shí)出現(xiàn)了休止期和成熟期(6月份精巢/卵巢：50%休止期和50%成熟期；7月份精巢：60%休止期和40%成熟期；7月份卵巢：66.7%休止期和33.3%成熟期)；10月份和12月份的精巢同時(shí)出現(xiàn)休止期、增殖期和生長(zhǎng)期(10月份：9.1%休止期、81.8%增殖期和9.1%生長(zhǎng)期；12月份：14.3%休止期、78.6%增殖期和7.1%生長(zhǎng)期)，10月份的卵巢出現(xiàn)了休止期(5.9%)、增殖期(64.7%)和生長(zhǎng)期(29.4%)，12月份的卵巢則涵蓋了休止期(15.4%)、增殖期(69.2%)、生長(zhǎng)期(7.7%)和成熟期(7.7%)。類似現(xiàn)象在櫛孔扇貝和青蛤(Cyclinasinensis)中也有報(bào)道。比如，2月份的櫛孔扇貝性腺同時(shí)出現(xiàn)增殖期和生長(zhǎng)期，12月份同時(shí)出現(xiàn)休止期和增殖期[5]；4月份的青蛤性腺同時(shí)出現(xiàn)休止期和增殖期，5月份同時(shí)出現(xiàn)增殖期和生長(zhǎng)期，6月份同時(shí)出現(xiàn)生長(zhǎng)期和成熟期[13]。可見(jiàn)，相比櫛孔扇貝和青蛤，蝦夷扇貝的性腺發(fā)育同步性較差，同一月份可同時(shí)涵蓋3種甚至4種發(fā)育時(shí)期。

3.2 不同貝類性類固醇激素含量的差異

本研究采用ELISA試劑盒檢測(cè)了蝦夷扇貝性腺中孕酮、睪酮、雌二醇三種激素的含量。其中，雌二醇的含量范圍(1.90～2.71 ng/g)與之前日本學(xué)者用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)的結(jié)果(1.6～4.6 ng/g)接近[9]。分析結(jié)果表明，蝦夷扇貝性腺中孕酮含量最高，雌二醇其次，睪酮最低。而在蛤仔(Ruditapesdecussatus)的性腺中，孕酮含量也明顯高于雌二醇和睪酮[4]。與已知的大多數(shù)軟體動(dòng)物相比，蝦夷扇貝性腺中孕酮(3.47～6.52 ng/g)、睪酮(0.64～1.02 ng/g)和雌二醇(1.90～2.71 ng/g)的含量較高。比如：在蛤仔性腺中孕酮、睪酮和雌二醇的含量分別為0.18～2.46、0.04～0.38、0.01～0.24 ng/g[4]，在櫛孔扇貝性腺中雌二醇和睪酮的含量分別為0.08～0.67和0.09～0.51 ng/g[5]。蝦夷扇貝性腺中性類固醇激素含量為何較高尚不清楚，有待后續(xù)研究。

3.3 貝類性類固醇激素隨生殖周期的變化

在蝦夷扇貝性腺4個(gè)發(fā)育階段，孕酮、睪酮、雌二醇的含量在精巢和卵巢之間均無(wú)顯著差異。而Osada等在之前的報(bào)道中也發(fā)現(xiàn)，在蝦夷扇貝性腺發(fā)育過(guò)程中，雌二醇的含量在精巢和卵巢之間并無(wú)差異[9]。類似的現(xiàn)象也存在于其它物種，比如，在淺溝蛤(Scrobiculariaplana)中，雌二醇的含量在雌雄性腺之間無(wú)顯著差異[14]，砂海螂(Myaarenaria)兩性性腺的睪酮和雌二醇水平差異也不顯著[15]。但并非所有的軟體動(dòng)物都呈現(xiàn)一致的變化趨勢(shì)，比如在縊蟶(Sinonovaculaconstricta)、福建牡蠣(Crassostreaangulata)、櫛孔扇貝等物種的性成熟過(guò)程中，精巢和卵巢的性類固醇激素水平就存在明顯差異，睪酮和雌二醇的含量隨著生殖周期發(fā)生變化[5,16-17]。

雖然孕酮、睪酮、雌二醇含量在蝦夷扇貝的精巢和卵巢之間并無(wú)顯著差異，但是本研究發(fā)現(xiàn)，3種激素含量的相關(guān)性在精巢和卵巢中有明顯不同，主要體現(xiàn)在雌二醇與其它兩種激素含量的相關(guān)性上，在精巢中是顯著的，但在卵巢中不顯著。而且雌二醇/睪酮在生長(zhǎng)期的精巢和卵巢之間差異顯著，卵巢的雌二醇/睪酮高于精巢。這表明性類固醇激素的性別二態(tài)分布在蝦夷扇貝生長(zhǎng)期是存在的。性腺雌二醇與睪酮的比值變化在櫛孔扇貝中也有報(bào)道，其卵巢中雌二醇/睪酮全年顯著高于精巢，而且生長(zhǎng)期是卵巢與精巢差異加劇的拐點(diǎn)[5]。以上結(jié)果暗示，蝦夷扇貝和櫛孔扇貝性腺可能都具有催化睪酮向雌二醇轉(zhuǎn)化的能力，即存在芳香化酶，且該酶的催化活性在生長(zhǎng)期的扇貝卵巢中高于精巢。但由于編碼芳香化酶的基因Cyp19A1僅在脊索動(dòng)物才開(kāi)始出現(xiàn)[18]，扇貝中的芳香化酶是否由P450家族的其它基因編碼，有待后續(xù)研究。