中國大鯢Cyp51基因特征與性腺表達分析

王全禾，李 偉，田海峰，孟 彥，肖漢兵，胡喬木*

(1.長江大學生命科學院，湖北荊州 434025；2.中國水產科學研究院長江水產研究所，武漢 430223)

CYP51蛋白(Lanosterol 14α-demethylase，CYP51)，即羊毛甾醇14α-脫甲基酶, 1984年首次在釀酒酵母中被發現，后經氨基酸測序被歸為Cyp51家族，是細胞色素酶CYP超家族中分布最廣的成員[1]。與其它P450成員不同,Cyp51 獨自分化成為一個超家族，所有動植物和一些菌類中都存在這種酶[2]。1994年，Aoyama等[3]發現大鼠肝型Cyp51基因編碼的蛋白與酵母的CYP51具有較高同源性，血紅素結合區的同源性為80%，其它區域的同源性超過60%。1996年Aoyama等[4]發現，人和大鼠CYP51的氨基酸一致性為93%，而且真菌與哺乳動物的Cyp51基因屬于直系同源基因。 同年，Kahn等[5]在高粱種子中發現了Cyp51基因, 而且它與哺乳動物和酵母CYP51的血紅素結合域都有較高一致性。隨后Bellamine等[6]在結核分枝桿菌中發現了與哺乳動物14α-脫甲基酶同源的CYP51蛋白。Yoshida等[7]對Cyp51基因進行研究分析，認為Cyp51基因家族起源于原核生物，并在真核生物中廣泛分布。

CYP51是生物甾醇合成途徑的關鍵酶，催化甾醇前體14α-甲基羥基化反應，經過3次單氧合反應依次將甲基氧化為醇，再氧化為醛，最后氧化為甲酸被釋放并形成Δ14,15雙鍵，從而使羊毛甾醇轉化為促減數分裂甾醇(Meiosis activating sterol, MAS)[2]。Xia等[8]利用腺苷酸環化酶激活劑誘導小鼠卵丘細胞，發現一種能夠使卵母細胞恢復減數分裂的物質，隨后Byskov等[9]鑒定出此類物質為甾醇。Ning等[10]研究發現小鼠卵丘細胞中的CYP51參與EGF受體信號調節，從而影響卵母細胞減數分裂；Zhang等[11]通過免疫組化技術檢測到Cyp51基因在小鼠的卵母細胞和顆粒細胞中表達，并發現卵泡促減數分裂甾醇(Follicle fluid meiosis activating sterol, FF-MAS)通過調節卵母細胞的減數分裂和凋亡參與原始卵泡的形成； Xie等[12]研究表明卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone, FSH)通過促減數分裂甾醇作為下游信號分子來啟動卵母細胞的成熟發育。由此可見Cyp51在動物性腺分化和發育中發揮重要作用，然而有關Cyp51的研究，多見于哺乳動物，兩棲動物中鮮有報道。

中國大鯢(Andriasdavidianus)別名“娃娃魚”，分類上屬于兩棲綱(Amphibia)有尾目(Urodela)隱鰓鯢科(Cryptobranchidae)大鯢屬(Andrias)，是世界上現存體型最大壽命最長且最為古老的兩棲動物[13]。據歷史記載，野生大鯢在我國四川，湖北，云南，浙江，湖南等多省有分布，由于人類的捕殺以及棲息地的破壞，野生大鯢種群數量銳減[14]。上世紀八十年代野生大鯢已被列為我國II級重點保護有尾兩棲類動物，1995年又被列入《瀕危野生動植物種國際貿易公約》附錄I中。大鯢與恐龍是同時期出現的兩棲物種，處于水生動物向陸生動物進化的特殊的地位，而Cyp51作為一種較為古老和保守的CYP家族成員，目前在兩棲物種中鮮有報道，因此對大鯢Cyp51基因的研究有助于豐富兩棲動物Cyp51家族生物學信息。 在前期研究中，利用1年齡大鯢雌雄性腺轉錄組測序以及比較轉錄組學分析，發現Cyp51基因在卵巢中的表達水平顯著性高于精巢中的表達水平，為深入研究該基因在大鯢性腺中的發育作用，通過前期轉錄組測序部分序列設計RACE引物，利用基因克隆技術獲得大鯢Cyp51 基因全長，對全長序列進行生物信息學分析；通過熒光定量PCR技術分析了Cyp51基因在大鯢不同組織、不同發育時期性腺以及正常大鯢和性反轉大鯢性腺中的表達模式，這些工作為今后深入了解大鯢性腺分化與卵巢發育的分子機制提供了參考和依據，同時豐富了兩棲物Cyp51基因生物學信息，有助于我們進一步了解兩棲動物性別分化的機制

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用大鯢均取自浙江金華永強大鯢養殖基地，取1年齡雌雄大鯢各三尾，取性腺, 腦, 胃, 肝, 腸, 腎, 脾, 肌肉, 心臟, 肺, 垂體等組織迅速投入液氮中，至實驗室后轉入-80 ℃低溫冰箱中保存, 用于RNA提取；在養殖條件下，大鯢性腺成熟周期常為6年，本研究通過對一個成熟周期不同年齡大鯢進行性腺樣本收集，取1年齡至6年齡大鯢為實驗材料，各年齡段雌雄大鯢各三尾，取精巢和卵巢后迅速投入液氮中用于RNA提取；分別取普通大鯢、高溫(28 ℃)與性激素誘導大鯢性腺以及肌肉組織，每個性腺組織分為兩份，一份液氮中保存用于RNA提取，一份4%多聚甲醛保存24 h后換70%無水乙醇保存用于組織切片制備，肌肉組織保存于無水乙醇用于基因組DAN提取。

1.2 生理性別與遺傳性別鑒定

采用組織切片技術結合顯微鏡觀察，鑒定大鯢生理性別；利用本實驗室開發的大鯢雌性特異標記Adf324鑒定大鯢遺傳性別[15]。 PCR反應體系：12.5 μL 2X Master Mix(TsingKe, China)； 基因組DNA 100 ng；特異引物各0.5 μL(10 μmol/L)；雙蒸水補足至25 μL。反應條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s， 60 ℃ 15 s， 72 ℃ 30 s，33循環；72 ℃ 5 min。如生理性別與遺傳性別一致則未發生性反轉，生理性別與遺傳性別不一致則發生性反轉，且生理性別鑒定為雄性，遺傳性別鑒定為雌性個體，稱為偽雄性個體(RM)；生理性別鑒定為雌性，遺傳性別鑒定為雄性個體，稱為偽雌性個體(RF)。

1.3 RNA提取及反轉錄

將RNA提取所用研缽，EP管等在DEPC水中過夜處理后，高溫高壓滅活DEPC酶。 取40 mg的組織于液氮中充分研磨，按照TRIzol法提取總RNA，提取的總RNA用DEPC水溶解后，進行瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性，超微量分光光度計測定其濃度。用DEPC水將完整性好的RNA進行濃度均一化處理，根據反轉錄試劑盒(TaKaRa)說明書將RNA反轉錄成cDNA，-20 ℃保存備用。

1.4 Cyp51基因克隆

根據本實驗室大鯢轉錄組數據庫中部分Cyp51基因部分序列，設計大鯢5′-RACE 與3′-RACE特性引物Cyp51S/Cyp51A(表1)。按照SMARTTM RACE試劑盒說明書構建5′-RACE-Ready cDNA,和3′-RACE-Ready cDNA 庫，并將其作為模板進行RACE擴增。反應體系按照說明書進行，反應程序為94 ℃, 30 s, 72 ℃, 3 min 5個循環；94 ℃ 30 s, 70 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 min再 5個循環； 94 ℃ 30 s, 68 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 min, 25個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物于1%瓊脂糖上電泳，切膠回收后產物與PMD-18T載體(TaKaRa)鏈接，再進行轉化克隆測序。

1.5 基因特征分析

將克隆獲得序列除去載體序列后，通過Vector NTI Advance 11軟件進行序列拼接獲得全長，利用NCBI上的Blastx 程序與GenBank數據庫進行同源比對，通過在線軟件ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)和CD-Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)找出開放閱讀框和保守域；利用Prot Scale(http://web.expasy.org/protscale/) 和 Prot Param(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質的親疏水性和理化性質；利用Prabi SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)預測蛋白的二級結構和結構域。利用Clustal X 軟件對推導的大鯢Cyp51基因的氨基酸序列與其它物種氨基酸序列進行比對分析；用PHYRE2 Protein Fold Recognition Server(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/)進行蛋白三級結構預測；通過ESPript 3.0(http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php)將大鯢同其他物種的氨基酸序列和二級結構進行比對分析； 利用MEGA 7.0軟件采用NJ法(neighbor-joining method)構建氨基酸系統進化樹。

1.6 熒光定量PCR

實時熒光定量PCR反應在QuantStudio 5(Applied Biosystems公司)反應系統上進行。β-actin為內參基因(表1)，cDNA作為模板，每個組織3個個體，每個反應重復3次。采用TaKaRa公司的SYBR ExScript RT-PCR Kit, 20 μL的反應體系：10 μL SYBR Premix Ex Taq(2X), 0.4 μL Cyp51S, 0.4 μL Cyp51A, 1 μL cDNA 和0.4 μL ROX reference dye II。 反應程序：95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s 40個循環; 熔斷曲線: 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s; 每個樣品重復 3 次。采用2-ΔΔCt法計算相對表達量，通過QuantStudio 5反應系統配套軟件QuantStudioTMDesign & Analysis Software 1.3.0設定內參和參考樣本，對獲得的表達量數據利用統計分析軟件SPSS 22.0對數據進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)， 當P<0.05時差異顯著，用不同字母表示；利用卡方檢驗分析不同發育時期雌雄性腺中表達差異，P<0.05時差異顯著，用*表示。

2 結果與分析

2.1 基因特征分析

利用Vector NTI軟件拼接得到Cyp51 cDNA全序列為1 975 bp(GenBank登錄號: MH713601)。其中5′UTR為135 bp， 3′UTR為331 bp且含有典型的poly(A)尾，開放閱讀框(ORF)為1 509 bp編碼503aa, 第66至第493位氨基酸區域為細胞色素P450超家族保守域(Cytochrome P450 superfamily conserved domain，P450 CD)(圖1-A)。將推導的氨基酸序列在NCBI數據庫中進行比對，結果顯示CYP51序列較為保守，從哺乳類到魚類的一致性為79%～82%，與兩棲類的熱帶爪蟾(Xenopustropicalis)和非洲爪蟾(X.laevis)同源性最高分別為85%和84%。通過 ExPasy ProtParam tool 預測，該基因編碼蛋白為親水性蛋白(親水性平均系數：-0.267)，分子式為C2561H3987N691O737S21，相對分子質量為56.93×103，等電點 PI 為 6.88。Prabi SOPMA 軟件預測結果顯示蛋白的二級結構包含50.20%的α-螺旋，9.96%的延伸鏈，3.59%的β-轉角，36.25%的無規則卷曲。Smart軟件分析結果顯示蛋白的三級結構含有3個低復雜度區段(Low complexity region, LCR)，1個熱休克伴侶蛋白結合基序(Heat shock chaperonin-binding motif, STi1)，1個雷帕霉素不敏感伴侶蛋白的中間域(Rapamycin-insensitive companion of mTOR, middle domain；RICTOR_M) domain)和1個高爾基體靶向結構域(Golgin-97, RanBP2alpha, Imh1p and p230/golgin-245 domain, GRIP)以及1個細菌轉錄激活域(Bacterial transcriptional activator domain, BTAD)(圖1-B)。

圖1 中國大鯢Cyp51基因cDNA序列與推導的氨基酸序列和保守域及其3D視圖

灰色區域為細胞色素P450超家族保守域；綠色虛下劃線為低復雜度區域；橙色雙下劃線為熱休克伴侶蛋白結合基序；棕色矩形為雷帕霉素不敏感伴侶蛋白的中間域；藍色下劃線為高爾基體靶向結構域；紅色六邊形為細菌轉錄激活域。

氨基酸序列比對結果顯示，在脊椎動物上，不同物種的CYP51在5個底物結合區域和血紅素結合區高度保守(圖2)，6個底物識別位點(substrate recognition sites, SRS)中的SDS-2, SDS-4, SDS-5三個位點以及血紅素結合區的氨基酸序列完全一致，SDS-1, SDS-3和SDS-6三個位點有1～2個氨基酸不同。

紅點鮭和眼斑雙鋸魚為外內群，利用MEGA 7.0 軟件構建分子系統進化樹,結果顯示，哺乳類、鳥類和爬行類聚為一支，兩棲類聚為獨立的一支(圖3)，且大鯢CYP51氨基酸序列與非洲爪蟾親緣關系最近，該結果符合物種一般進化規律。

圖2 中國大鯢CYP51氨基酸序列

圖3 基于大鯢與不同物種Cyp51氨基酸序列的NJ進化樹分析

2.2 組織表達分析

利用特異引物，通過RT-PCR反應進行相對定量表達分析，檢測大鯢Cyp51基因在肌肉、垂體、腦、腎、腸、胃、肝臟、肺、脾臟、精巢、卵巢和心臟等12個組織的表達水平，結果顯示(見圖4-A)，該基因在卵巢中呈顯著性高表達，肝臟和腎中次之(P<0.05)，在其余組織表達水平較低無顯著性差異(P>0.05)。不同時期大鯢性腺的表達結果顯示(圖4-B)，Cyp51基因在1-5Y時期大鯢卵巢中表達水平都顯著高于在精巢中的表達水平(P<0.05)；在6Y時期卵巢與精巢表達水平無顯著性差異(P>0.05)。在1-4Y時期卵巢中的Cyp51基因表達水平不斷上升至最高；從5Y開始逐漸降低，6Y時至最低水平且雌雄性腺表達無顯著性差異(P<0.05)；其在精巢中的表達水平從1Y至6Y整體呈現先增后降的趨勢，在1-3Y時期表達水平不斷上升至最高， 4-6Y逐漸下降，降至與1Y時期的表達水平接近。Cyp51基因在普通大鯢和性反轉大鯢性腺中的表達結果顯示，該基因在反轉雌性卵巢中的表達水平最高，普通雌性卵巢中的表達水平次之，普通和反轉雄性個體精巢中的表達水平最低(P<0.05)，反轉雄性比普通雄性個體精巢中的表達水平低但無顯著性差異(P>0.05)(圖4-C)。

圖4 大鯢Cyp51基因表達分析

3 討論

在本研究中，我們從大鯢性腺轉錄組中分離克隆了Cyp51基因,得到全長1 975 bp的cDNA序列,推導出該基因ORF為1 509 bp 編碼503個氨基酸。大鯢與其他物種的CYP51氨基酸序列比對結果顯示，CYP51的6個底物識別區域在大鯢和其他物種上高度保守，與CYP51直向同源進化的保守性相吻合[2]。CYP51的功能區的氨基酸序列嚴格保守以保證其催化活性，Cyp51家族的分類原則與P450家族不同，P450家族要求序列相似性大于40%，而CYP51在整個生物界的相似性則在30%左右[1,16]。CYP51家族成員的初級結構一致性較低，而二級結構和三級結構較為嚴格和保守[2]。CYP51蛋白有6個高度保守的區域，5個底物結合區和1個血紅素結合區[7, 16]，血紅素結合區域在所有P450s中都很保守[17]；SRS-1～SRS-6中的SRS-1和SRS-4尤為保守，被作為特征信號用以鑒定CYP51家族的成員[1]。大鯢CYP51的SRS區域與SMART軟件預測的結構域存在重疊部分，SRS-2、 SRS-3、SRS-4、LCR-3和GRIP結構域都包含于BTAD區域，SRS-3包含于GRIP結構域，LCR-3又包含于SRS-4區域，這些區域在作用和功能上的分工-協作關系有待進一步研究。以魚類作為外內群，進行系統發育進化樹分析，結果顯示：大鯢與熱帶爪蟾和非洲爪蟾聚為一支，而哺乳類，爬行類和鳥類聚為另一支，鯨鯊作為軟骨魚類與斑點雀鱔、象鼻魚、眼斑雙鋸魚和紅點鮭聚為一支，符合動物進化的一般規律。以上結果表明Cyp51基因在不同類群上的進化較為保守，Cyp51基因在進化過程中的高度保守性正是其在真核生物膽固醇合成過程中發揮作用的前提，而發生在動物上的突變也常常是同義突變，如果突變導致固醇結合能力喪失，最終會導致假基因的形成或者造成基因丟失，甚至影響動物正常的固醇合成和繁殖活動[1, 16]。CYP51蛋白存在于大多數細胞的內質網中，通過高爾基體進行轉運[16]。SMART結構預測結果顯示，在P450保守域中除了包含6個SRS區域，還包含GRIP結構域和BTAD結構域，其中GRIP結構域涉及高爾基體靶向轉運[18]，后者涉及指導肌動蛋白合成[19]。從魚類到哺乳類，CYP51序列、結構域和功能域都具有高度的保守性，從而保障了CYP51參與固醇合成這一重要代謝功能的完備。

大鯢不同組織的表達結果顯示，Cyp51基因在卵巢中豐度最高，肝臟和腎臟次之，其余組織豐度較低。Cyp51 mRNA在牛[20]，豬[21]，大鼠[22]和雞[23]的睪丸和肝臟中都顯示高水平表達；而其在牛的肺和腎臟中也顯示高水平表達[20]，但在豬的肺和腎臟中顯示低水平表達[21]；在雞上，腸組織的Cyp51豐度最低[23]，但在斑馬魚上，Cyp51在腸組織中豐度最高[24]。在大鼠上，Cyp51 mRNA在所有組織中表達，睪丸中存在特異的轉錄本故豐度最高[22]；睪丸特異型轉錄本產生于上游多聚腺苷酸化位點，僅限于生殖細胞，在VII-XIV期伸長精子中最豐富，而體細胞轉錄本存在于所有細胞中[22]。在Cyp51基因敲除小鼠上的研究表明，雄性生殖細胞中MAS和膽固醇的從頭合成并非精子發生所必需的[25]。而在小鼠卵母細胞上的研究表明，促卵泡激素FSH利用Cyp51作為中介調控者，通過MAS開啟卵母細胞減數分裂[26]。由此可見，Cyp51在不同物種上的組織表達模式存在差異。Cyp51基因在不同時期的大鯢性腺中的表達結果顯示，Cyp51基因隨著卵巢的發育表達量不斷上升，在卵巢發育接近成熟時其表達量開始下降，當卵巢發育成熟時表達量降至較低水平；精巢中表達量隨著精巢發育逐漸增加，增至一定水平便開始逐漸下降，而且在1-5Y各個時期精巢的表達量都顯著低于(P<0.05)在卵巢中的表達量，在卵巢和精巢中表達量高峰分別在4Y和3Y。而Cyp51在仔雞和成年雞的睪丸中都有表達，但在成年雞上的表達水平顯著高于仔雞[23]。在斑馬魚上, 從成熟前期到成熟期再到成熟后期，Cyp51在精巢中的表達水平都顯著高于卵巢，在精巢中呈現先降后增的變化趨勢，在卵巢中則呈現遞增的變化趨勢[27]。這表明，Cyp51在不同物種性腺中表達量和變化趨勢也具有特異性。Cyp51在正常和性反轉大鯢性腺中的表達結果顯示，該基因在正常和性反轉雌性大鯢性腺中的表達量都顯著高于正常和性反轉雄性大鯢性腺中的表達量(P<0.05)，性反轉雌性大鯢性腺中豐度最大，正常雌性大鯢次之，性反轉雄性大鯢和正常雄性大鯢性腺中豐度較低，正常雄性大鯢最低。CYP51催化羊毛甾醇轉化為FF-MAS，FF-MAS在△-14還原酶作用下轉化為T-MAS(Testis meiosis activating sterol,T-MAS),兩者都能參與調節生殖細胞的減數分裂，減數分裂是有性生殖所必須的細胞分裂，并由此產生單倍體配子[16]，CYP51對于大鯢性腺分化和發育也有著同樣重要的作用，所以Cyp51在性反轉大鯢性腺中的表達水平高于正常大鯢性腺中的水平。以上關于大鯢組織表達的結果表明，Cyp51在大鯢不同組織和不同時期性腺中以及正常與性反轉大鯢性腺中都一致顯示在卵巢中高表達，由此可以確定Cyp51基因對于大鯢卵巢分化與發育中有著重要作用，而具體機制還有待進一步研究。