青魚Dazl基因的原核表達及其多克隆抗體制備

王藝舟，潘啟華，王 乾，夏必琳，羅君志，方 健，鄧 羽，廖明聰，陳天圣，2

(1.華中農業大學水產學院，農業部淡水生物繁育重點實驗室，武漢 430070；2.水產高效健康生產湖南省協同創新中心，湖南常德 415000)

Dazl(Deleted in Azoospermia-like)基因是DAZ基因家族的一員[1-3]，其編碼RRM(RNA recognition motif)RNA結合蛋白，是動物生殖細胞中非常重要的翻譯調控因子[4-5]。Dazl基因最早由Eberhart從蠅類睪丸組織中獲得，是一個性腺特異性表達的基因[3]。在成體動物睪丸組織中，Dazl主要分布于精原細胞和初級精母細胞的細胞核中，而在粗線期精母細胞中則主要分布在細胞質中，這揭示了在減數分裂中Dazl完成了從精原細胞的細胞核向次級精母細胞的細胞質內遷移的過程[6]。Dazl表達的增加或下降顯著影響生物體的發育和生殖[7]，在非洲爪蟾(Xenopuslaevis)中XDazl基因的缺失會導致原始生殖細胞的形成受到阻礙[8]；小鼠(Musmusculus)Dazl基因敲除后，發現雌性生殖細胞只能停滯在第一次減數分裂前期，而雄性生殖細胞在有絲分裂過程中就會受到影響，最終導致雌雄雙方都無法產生成熟配子[9]；在人類中，Dazl基因的缺失或突變會導致精子缺乏癥和男性不育[6]。

Dazl基因在魚類中的研究報道主要集中在斑馬魚(Daniorerio)[10]、青鳉(Oryziaslatipes)[11]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[12]、鯉魚(Cyprinuscarpio)[13]、半滑舌鰨(Clariasgariepinus)[14]、亞洲鱸魚(Asianseabass)[15]、中華鱘(Acipensersinensis)[16]等，其研究內容主要集中在RNA水平的表達和與原始生殖細胞的形成等關聯，Dazl蛋白只在青鳉、鯉魚、中華鱘等少數魚類中有報道[11，13，16]，但是魚類Dazl抗原保守性不高導致抗體不能跨物種使用。我們聚焦于青魚(Mylopharyngodonpiceus,Mp)的生殖細胞研究，青魚是我國傳統的“四大家魚”之一，2017年的中國漁業統計年鑒結果表明青魚總產量位于全國淡水魚產量的第8位[17]，其具有個體大、生長速度快、肉質鮮美等優點，但其繁殖周期較長，目前關于青魚的研究主要集中于人工繁殖[18]、養殖[19]、營養[20]、抗病[21]、資源分布[22]等方面，對于在生殖細胞c方面的相關研究少有報道。Dazl是許多生物中生殖細胞的形成和配子發生所必需的翻譯調控因子，是生殖細胞中特異表達的分子標記。本實驗室已經在青魚卵巢中分離和鑒定Dazl基因，將其命名為MpDazl(GanBank: KY829471)，本研究在此基礎上開展青魚Dazl蛋白原核表達、抗體的制備以及抗體特異性的驗證，為下一步研究青魚生殖細胞的分離和標記奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大腸桿菌(Escherichiacoli)TOP 10和BL21購自北京全式金生物技術有限公司；載體pCS2、pET-28a、pT2BH-pr、pFastBac均為本實驗室保存或構建；青鳉肌肉細胞系(OLM)由本實驗室建立并保存；青魚購自武漢水產市場。

1.2 實驗方法

青魚Dazl原核表達載體的構建與鑒定 根據實驗室已獲得的pCS2-MpDazl質粒和pET-28a載體的酶切位點分析結果，利用Primer 5軟件設計引物(Mp-Dazl-cds F 5′-AAAGCTAGCATGGTTTTAGATATGGATATCCAG-3′/ Mp-Dazl-cds R 5′- AAACTCGAGCAGAAGGGTTAGCAAAGTC-3′)。以pCS2-MpDazl為模板進行PCR擴增，利用DNA膠回收試劑盒(Omega，美國)回收純化PCR產物，將回收產物與pET-28a質粒進行NheI和XhoI(NEB，美國)在37 ℃酶切后于進行回收于16 ℃連接。將連接產物轉化到大腸桿菌TOP 10后，挑取克隆后用質粒提取試劑盒(Omega，美國)提取質粒pET-28a-MpDazl，所提質粒進行酶切鑒定并測序。

Dazl原核表達和表達條件優化 將pET-28a-MpDazl轉化至BL21菌中，挑取陽性克隆接種到LB液體培養基中培養12 h，再次接種至新鮮LB培養基中至OD600 mm為0.6～0.8時，利用IPTG誘導表達后，通過離心回收菌體，在菌體中加入20 μL蛋白上樣緩沖液(CW0052S，康為世紀)煮沸10 min，離心后取上層液體20 μL進行SDS-PAGE(康為世紀)電泳分析。表達條件優化：(1)將已獲得的陽性菌液按照1%的濃度接種到LB液體培養基中37 ℃培養1 h，以終濃度為0.5 mmol/L和1 mmol/L的IPTG分別誘導3 h；(2)將已獲得的陽性菌液按照1‰的濃度接種到LB液體培養基中37 ℃培養1 h，以終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導，在25 ℃和37 ℃分別誘導2、3、4 h后取樣，以確定最佳誘導時間和溫度。

融合蛋白表達形式鑒定 將含有pET-28a-MpDazl重組質粒的菌液離心并去上清，以1/10菌液體積的PBS重懸沉淀，冰浴中超聲波破碎菌體，超聲條件為功率400 W超聲5 s間隔10 s至菌液澄清，收集上清和沉淀，分別進行10% SDS-PAGE電泳分析。

融合蛋白抗體制備與效價檢測 將含有pET-28a-MpDazl菌體誘導蛋白，大量表達蛋白后取沉淀用尿素洗脫純化后[23-24]，將弗氏佐劑加入到純化好的蛋白中，選取2只健康的白兔將乳化好的產物分別進行背部多點皮下注射。第一次免疫7 d，后續每隔兩周加強免疫一次，4次免疫后取血分離血清。利用ELISA反應，測定抗體效價。武漢愛博泰克生物科技有限公司協助完成蛋白純化和免疫等工作。

多克隆抗體特異性檢測 取青魚的腦、眼、心、腎、肝、脾、卵巢各0.5 g，用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，檢測多克隆抗體是否特異識別青魚卵巢組織中的蛋白[23-24]。多克隆抗體檢測青鳉肌肉細胞系(OLM)表達的外源MpDazl蛋白，將已構建對照質粒pT2BH-pr和表達外源MpDazl蛋白Dazl的pFastBac-MpDazl質粒分別轉染OLM細胞中，檢測其中Dazl蛋白表達情況。轉染前將OLM細胞以1×106個/孔接種于六孔板中，28 ℃培養箱中培養。24 h后用LipofectamineTM2000(Invitrogen，美國)進行轉染，每孔加6 μL轉染試劑及2 μg質粒，48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。用蛋白抽提試劑盒提取不同轉染細胞蛋白，進行Western blot分析。

2 結果

2.1 青魚Dazl原核重組載體的構建與鑒定

以質粒pCS2-MpDazl為模板擴增MpDazl編碼區(coding sequence, CDS)。將擴增出的MpDazlCDS 648 bp產物與pET-28a載體分別用NheI和XhoI雙酶切，酶切產物經T4連接酶連接構建了原核表達載體pET-28a-MpDazl(圖1A、B)，原核表達載體pET-28a-MpDazl經酶切后依次得到大小為5 543 bp和406 bp的片段，均與預期長度一致(圖1C)。將構建的載體送測序，確定插入片段準確無誤。

圖1 MpDazl原核表達載體構建

2.2 Dazl融合蛋白的表達和誘導條件優化

將pET-28a-MpDazl載體轉入大腸桿菌中，其經過IPTG誘導后通過SDS-PAGE電泳分析，結果表明有約27 kD的目的條帶。IPTG誘導濃度優化結果顯示，在0.5 mmol/L和1 mmol/L的IPTG誘導條件下pET-28a-MpDazl融合蛋白表達量無明顯差異(圖2A)，因此選擇0.5 mmol/L IPTG濃度進行誘導表達。IPTG誘導時間和溫度優化結果表明不同溫度無明顯差異，在誘導2、3、4 h后各融合蛋白均有一定的表達，其中在誘導4 h目的蛋白表達量最高，所以選擇4 h進行大量誘導(結果未顯示)。

圖2 His-Dazl融合蛋白表達的優化

2.3 Dazl融合蛋白表達及純化

pET-28a-MpDazl菌體蛋白以上清和包涵體兩種形式存在，其主要分布在包涵體中(圖2B)。誘導pET-28a-MpDazl菌體蛋白大量表達后用尿素洗脫純化，通過蛋白電泳后采用軟件分析，灰度其純度達90%以上，能夠滿足后續抗體制備需求。

2.4 多克隆抗體特異性檢測及應用

所得青魚Dazl多克隆抗體效價為1∶256 000(表1)，可以進行抗原的特異性識別。抗體對不同濃度抗原的識別結果表明抗體能有效地檢測抗原(圖3A)。原核表達的蛋白提取液和表達內源Dazl的組織蛋白提取物Western blot分析結果表明所制備多克隆抗體可特異識別菌體裂解液中目的蛋白(圖3B)；并且能特異識別青魚卵巢Dazl蛋白，這也證明Dazl蛋白具有性腺表達的特異性(圖3C)。此外，將pT2BH-pr和pFastBac-MpDazl質粒分別轉染OLM細胞中均能檢測到紅色熒光(圖4A、B)。轉染后OLM細胞蛋白Western blot結果顯示，在轉染pFastBac-MpDazl的細胞后能檢測出表達的Dazl蛋白(圖4C)。通過以上結果說明制備的兔抗青魚Dazl多克隆抗體能夠有效識別原核表達的Dazl蛋白、內源的Dazl蛋白和真核細胞過表達的Dazl蛋白，可用于后續研究中的Dazl蛋白檢測。

表1 ELISA檢測Dazl抗體效價

圖3 多克隆抗體特異性檢測

圖4 多克隆抗體應用于轉染細胞蛋白檢測

3 討論

本實驗采用原核表達系統，成功構建青魚Dazl基因的原核重組表達載體pET-28a-MpDazl，在大腸桿菌中獲得帶有組氨酸標簽的Dazl重組蛋白。為了有效地獲得重組蛋白，從IPTG濃度、溫度和誘導時間三個方面對表達條件進行優化。結果表明，溫度與IPTG濃度無顯著性差異，誘導4 h后蛋白表達量最高。考慮到高濃度的IPTG和大腸桿菌生長的最適溫度這兩個因素可能會影響大腸桿菌的生長，所以選擇37 ℃，0.5 mmol/L IPTG和誘導4 h為獲得His-Dazl重組蛋白的最佳條件。SDS-PAGE電泳結果表明，His-Dazl重組蛋白在菌體沉淀中表達最多，表明重組蛋白主要以包涵體的形式存在。我們在最適條件下大量表達了重組蛋白，并在蛋白變性的條件下用8 mol/L尿素純化。包涵體氫鍵在尿素的作用下有很強的可逆性變性作用，當尿素濃度8～10 mol/L時，包涵體的溶解度可達70%～90%。選用尿素溶解的優點是它具有非離子化，呈中性，低成本等特點，而且復性后的蛋白不會導致大量蛋白質沉淀[25]。以純化的蛋白作為抗原，免疫家兔制備His-Dazl多克隆抗體。ELISA分析結果表明，抗體效價高達256 000。His-Dazl抗體與原核表達的蛋白進行雜交，在約為27 KU處有一條明顯的單一條帶，說明制備的多克隆抗體能特異性識別重組蛋白；在青魚不同組織蛋白中只有在性腺中檢測到目的條帶，這說明其能特異性地識別青魚卵巢組織中的Dazl蛋白；我們還建立了過表達Dazl基因的魚類細胞系，在其中也檢測到目的條帶，結果表明其能識別外源c表達的Dazl蛋白。因此以上結果都說明制備的青魚Dazl抗體特異性好。

在斑馬魚[10]、青鳉[11]、鯉[13]、半滑舌鰨[14]、亞洲鱸[15]、中華鱘[16]、羅非魚[26]等物種中也陸續研究Dazl，Dazl的RNA或者蛋白都局限于性腺中表達，均能說明它是生殖細胞特異的分子標記。本研究使用制備的抗體檢測了Dazl蛋白在青魚不同成體組織中的表達情況，也證實了該蛋白在性腺中特異表達。該結果與之前Dazl蛋白在魚類和哺乳動物中所得到的研究結果類似，同時也暗示Dazl蛋白在青魚的性腺發育和分化中起著重要的調控作用，為后期研究Dazl蛋白在青魚生殖細胞中的應用奠定基礎。