36種中藥對(duì)羅非魚源無乳鏈球菌體外抑菌及生物被膜消除效果

丁 浩，董 靖，宋 懌，蘇志俊，余琳雪，艾曉輝

(1.上海海洋大學(xué)，上海 201306；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；3.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京 100125；4.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100125；5.湖北省水產(chǎn)品質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，武漢 430223)

近年來羅非魚各種急性傳染性疾病的流行呈上升趨勢(shì)[1]，其中羅非魚鏈球菌病是羅非魚養(yǎng)殖中最為常見的一種疾病，該病給我國(guó)羅非魚養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)報(bào)道，2009-2011年，羅非魚鏈球菌病持續(xù)暴發(fā)，死亡率高達(dá)90%[2]，直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)20億元[3]。無乳鏈球菌具有廣泛的宿主感染性，不但能引起魚類鏈球菌病，還對(duì)哺乳動(dòng)物、兩棲動(dòng)物具有致病性[4]。目前，抗生素是治療水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病的主要手段之一，具有不可替代的作用。但由于在臨床實(shí)踐中由于抗菌藥物的不合理使用導(dǎo)致了藥物殘留和耐藥性產(chǎn)生等問題，對(duì)人類健康和水產(chǎn)品質(zhì)量安全產(chǎn)生潛在的威脅[5]。而有研究表明，細(xì)菌生物被膜具有極強(qiáng)的抗藥性及抗吞噬、抗趨化作用，有研究發(fā)現(xiàn)，生物被膜上細(xì)菌群體耐藥性可以達(dá)到該細(xì)菌浮游狀態(tài)的1 000倍[6]。因此應(yīng)加強(qiáng)抗菌藥物替代品的研發(fā)，逐步用無耐藥性、無有害殘留的替代品取代抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的作用，以確保水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。

現(xiàn)階段，利用中草藥防治魚類疾病備受關(guān)注。國(guó)內(nèi)外已有許多學(xué)者研究過中草藥對(duì)人類和畜禽常見致病菌的抑菌效果，均證明了中草藥具有不同程度的抑菌作用，而且中草藥具有低毒、低殘留、副作用小、不易誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)[7,8]。目前已有不少關(guān)于中草藥抑殺水產(chǎn)病原菌的報(bào)道，如：石榴皮和地榆能體外抑制海水養(yǎng)殖鱸魚病原菌河弧菌(Vibruofluvialis)、鰻弧菌(V.anguillarum)、哈氏弧菌(V.harveyi)[9]；寧夏枸杞和黃芪在草魚和吉富羅非魚體內(nèi)能抑制嗜水氣單胞菌[10]。此外中草藥成分復(fù)雜多樣，既有抗菌成分, 又能提高自身抗病能力[11,12]，具有開發(fā)成綠色漁藥的前景。本試驗(yàn)選取36種中藥單體天然化合物，研究其對(duì)羅非魚無乳鏈球菌體外抑菌試驗(yàn)和血根堿作用下細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的變化及抑制生物被膜形成揭示藥物的抑菌過程及效果，為中草藥防治羅非魚無乳鏈球菌病害提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiate)菌株333、319由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所李愛華研究員惠贈(zèng)；菌株P(guān)BSA0903由海南大學(xué)郭偉良博士惠贈(zèng)。

1.1.2 藥物與試劑

中藥單體天然化合物購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院(純度HPLC>98%，批號(hào)：140521)；腦心浸液肉湯(BHI)購(gòu)自青島海博生物技術(shù)公司、水解酪蛋白(MH)購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司，結(jié)晶紫購(gòu)自上海士鋒生物科技有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

生物安全柜購(gòu)自新加坡ESCO；全自動(dòng)化新型生化培養(yǎng)箱購(gòu)自上海智成分析儀器制造有限公司、恒溫?fù)u床購(gòu)自上海智成分析儀器制造有限公司；離心機(jī)購(gòu)自大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司；牛津杯(內(nèi)徑6 mm，外徑7.8 mm，高10 mm)購(gòu)自上?；茖?shí)驗(yàn)器材有限公司；紫外分光光度計(jì)購(gòu)自上海優(yōu)尼科儀器有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 菌液的制備

將無乳鏈球菌接種于液體培養(yǎng)基中, 在30 ℃搖床中振蕩(200 r/min)培養(yǎng)過夜, 吸取1 mL菌液于1.5 mL離心管中，10 000 r/min，離心1 min，舍去菌液上清，用無菌生理鹽水稀釋菌體至1.5×108CFU/mL(0.5麥?zhǔn)媳葷岫葐挝?備用。

1.2.2 藥液的配制

水溶性好的中藥單體天然化合物以蒸餾水配制、水溶性不好的中藥單體則用二甲基亞砜(DMSO)配制成儲(chǔ)存液(40 960 μg/mL)；試驗(yàn)時(shí)用培養(yǎng)基稀釋，DMSO終濃度<0.5%；抑菌試驗(yàn)中36種中藥單體天然化合物濃度以水調(diào)試為1 mg/mL；采用牛津杯在每個(gè)MH瓊脂平板打孔3個(gè)備用。

1.2.3 抗菌活性的測(cè)定

以滅菌棉拭子蘸取供試無乳鏈球菌的菌懸液分別均勻涂布接種于直徑9 cm MH瓊脂平板，待自然稍干后，向已打孔MH瓊脂平板孔內(nèi)滴加供試中藥(濃度為1 mg/mL)，每孔30 μL，設(shè)置1 mg/mL DMSO對(duì)照組，置30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀察并以游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑的大小，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每孔取不同方向測(cè)2次，最終求6次測(cè)量的平均值[13]。

1.2.4 最小抑菌濃度(MIC)及最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定

利用微量稀釋法藥敏實(shí)驗(yàn)的方法測(cè)定36種中藥單體天然化合物對(duì)受試菌株的最小抑菌濃度[14]。將配置好的中藥和純DMSO加入每孔載有100 μL BHI培養(yǎng)基96孔板中，每種藥液均設(shè)置三組平行，DMSO在每孔中含量均小于1%。第11列和第12列加不含藥的BHI培養(yǎng)液，其中第11列做為生長(zhǎng)對(duì)照接種菌液，第12列做為空白對(duì)照不接種菌液。用BHI培養(yǎng)液將備用菌液濃度稀釋至1.5×106CFU/mL的工作菌液，加入1至11列每孔100 μL，使第1孔至第10孔藥物濃度為512、256、128、64、32、16、8、4 、2、1 μg/mL，第12列孔不加菌液，為空白對(duì)照空。放入恒溫培養(yǎng)箱30℃培養(yǎng)24 h后肉眼觀察，每個(gè)平行中無菌生長(zhǎng)小孔對(duì)應(yīng)的濃度即為最小抑菌濃度。

將篩選出的5種抑菌效果好的藥物的MIC和高于MIC濃度的各個(gè)梯度的試管中的培養(yǎng)物0.1 mL，轉(zhuǎn)接于BHI瓊脂培養(yǎng)基平板，30°C培養(yǎng)24 h后觀察有無菌落形成，無菌落形成的相應(yīng)試管中的最低藥物濃度即為該種藥物對(duì)無乳鏈球菌的最小殺菌濃度(MBC)。

1.2.5 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

選取抗菌效果較好的一種中藥單體做生長(zhǎng)曲線測(cè)定，將準(zhǔn)備好的裝有20 mL BHI培養(yǎng)基的15個(gè)50 mL錐形瓶滅菌，分成A、B、C三組備用。加入7.80、3.90、1.95、0.98 μL待試藥品，設(shè)置16、8、4 、2 μg/mL及不加藥空白對(duì)照組，然后再向每個(gè)錐形瓶中接入對(duì)應(yīng)菌液0.1 mL(添加菌液之前吸取0.1 mL培養(yǎng)基棄去以消除加菌后總體積變化對(duì)試驗(yàn)影響)，適當(dāng)振蕩混勻。制成上述混合培養(yǎng)液后即進(jìn)行第一次OD600nm值的測(cè)定，測(cè)定后將錐形瓶置于30 ℃恒溫培養(yǎng)搖床中培養(yǎng)。之后每間隔1 h測(cè)定并記錄OD600nm值一次，OD600nm值測(cè)定時(shí)以未接種細(xì)菌的BHI培養(yǎng)基作空白，每次測(cè)定時(shí)需在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行取樣，讀取并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.6 生物被膜模型的建立及不同藥物濃度作用下成膜的測(cè)定

細(xì)菌生物被膜的形成和測(cè)定參考文獻(xiàn)[15]的方法并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。具體步驟如下：在無菌96孔板中每孔加入BHI 培養(yǎng)液200 μL，再加入血根堿，使終濃度分別為32、16、8、4、2、1、0 μg/mL，再加入菌懸液10 μL(麥?zhǔn)媳葷岫?.5)，以無菌BHI培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照。將孔板放置于濕盒, 30 ℃孵育48 h， 每組做3個(gè)平行孔, 棄去96 孔板中的培養(yǎng)液，再向每孔中加入250 μL PBS，并吸棄，如此洗膜3次。將附著在96 孔板上的被膜用200 μL甲醇固定30 min。棄去固定液，待自然風(fēng)干后，室溫下用200 μL 0. 1% 的結(jié)晶紫對(duì)生物被膜染色30 min，棄去染色液，用PBS洗2次，干燥。將干燥的96 孔板中加入200 μL 33%乙酸溶液，置于搖床振搖30 min 以釋放結(jié)晶紫染液。用酶標(biāo)儀在630 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)36種中藥單體天然化合物的抗菌活性

由表1可見，三株無乳鏈球菌對(duì)不同中藥單體天然化合物的敏感程度不同，相同濃度DMSO對(duì)受試細(xì)菌抑菌圈為0，其中333對(duì)15種中藥單體抑菌圈>10 mm，PBSA0903對(duì)12種天然化合物抑菌圈>10 mm，319對(duì)13種中藥單體抑菌圈>10 mm。經(jīng)對(duì)比分析可知：三株無乳鏈球菌對(duì)血根堿、白屈菜紅堿、和厚樸酚、厚樸酚、大黃酸抑菌圈>20 mm，對(duì)白藜蘆醇、黃芩素表現(xiàn)為高敏，對(duì)柚皮素、二氫辣椒堿、黃連素、二氫楊梅素、丹皮酚、大黃酚、秦皮素、辣椒堿、山奈酚和金絲桃苷表現(xiàn)出不同的敏感程度，對(duì)其余中藥單體抑菌圈<10 mm。

表1 36種中藥單體對(duì)3株無乳鏈球菌細(xì)菌的體外抑菌作用

2.2 中藥單體的MIC及MBC

36種中藥單體對(duì)無乳鏈球菌的MIC測(cè)定結(jié)果顯示，各種藥物對(duì)三株鏈球菌抑菌效果表現(xiàn)一定程度的一致性，DMSO對(duì)照組MIC大于512 μg/mL，試驗(yàn)菌生長(zhǎng)正常，其中血根堿、白屈菜紅堿、和厚樸酚、大黃酸、厚樸酚5種中藥單體對(duì)無乳鏈球菌最小抑菌濃度為8～32 μg/mL，抑菌活性最為明顯；其次為二氫辣椒堿。二氫楊梅素、丹皮酚、大黃酚、山奈酚表現(xiàn)出較弱抑菌活性；其余中藥單體對(duì)無乳鏈球菌無明顯抑菌活性。詳見表2。

表2 中藥單體對(duì)三株無乳鏈球菌MIC

5種中藥單體對(duì)3株細(xì)菌的MIC和MBC的測(cè)定結(jié)果見表 3。結(jié)果顯示：血根堿對(duì)無乳鏈球菌333的抑殺效果最明顯，MIC、MBC值均最小，分別為8 μg/mL和16 μg/mL，和厚樸酚與厚樸酚其次，MIC和MBC均為16 μg/mL，血根堿對(duì)無乳鏈球菌319和PBSA0903的MIC和MBC均為16 μg/mL，大黃酸、厚樸酚與和厚樸酚對(duì)其MIC、MBC均為16 μg/mL，效果優(yōu)于其他四種藥物，白屈菜紅堿相對(duì)其他4種中藥單體表現(xiàn)出較弱的抑殺效果。綜合分析，血根堿對(duì)三株無乳鏈球菌的抑殺效果最好。

表3 有效藥物對(duì)無乳鏈球菌的最小殺菌濃度(MBC)和最小抑菌濃度(MIC)

2.3 生長(zhǎng)曲線

本試驗(yàn)選取對(duì)無乳鏈球菌抑殺效果最好的血根堿，并測(cè)定其對(duì)三株受試細(xì)菌生長(zhǎng)趨勢(shì)的影響。結(jié)果顯示，加入不同濃度血根堿的受試細(xì)菌，從生長(zhǎng)曲線可看出對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期OD600 nm值均位小于對(duì)照組，且濃度越高，OD600 nm值越小。菌株333與319對(duì)數(shù)期起始時(shí)間隨著藥物濃度增大有所推遲，333空白對(duì)照組、2 μg/mL組和4 μg/mL組的對(duì)數(shù)期起始時(shí)間分別為2 、3 、4 h，319空白對(duì)照組的對(duì)數(shù)期起始時(shí)間分別為2 、3 、4.5 h。其中8 μg/mL、16μg/mL兩組在其余三組達(dá)到對(duì)數(shù)期后依然停留在遲緩期，詳見圖1、2。PBSA0903生長(zhǎng)周期長(zhǎng)于其他兩株受試細(xì)菌，且血根堿對(duì)其作用效果明顯強(qiáng)于其他兩株細(xì)菌，當(dāng)血根堿濃度達(dá)到4 μg/mL時(shí)，其生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期延遲到第13 h，表明鏈球菌生長(zhǎng)受到明顯抑制，而且這種抑制效果表現(xiàn)在細(xì)菌生長(zhǎng)周期的各個(gè)時(shí)期，詳見圖3。

圖1 不同血根堿濃度下無乳鏈球菌333的生長(zhǎng)曲線

圖2 不同血根堿濃度下無乳鏈球菌319的生長(zhǎng)曲線

圖3 不同血根堿濃度下無乳鏈球菌PBSA0903的生長(zhǎng)曲線

2.4 血根堿對(duì)生物被膜形成能力的影響

測(cè)定抑菌效果相對(duì)強(qiáng)的血根堿和抑菌效果相對(duì)弱的綠原酸對(duì)無乳鏈球菌333生物被膜生成率的影響。濃度為 32、16、8、4、2、1、0 μg /mL 血根堿和綠原酸作用無乳鏈球菌 333，以未加藥物的陽性對(duì)照，顯示血根堿濃度由高到低的作用下無乳鏈球菌生物被膜的生成率分別為0.59%、2.76%，60.21%、76.59%、96.69%、96.96%，綠原酸作用下受試細(xì)菌生物被膜生成率分別為94.03%～96.50% (圖4)。結(jié)果顯示：一定濃度的血根堿對(duì)無乳鏈球菌被膜有明顯的抑制作用，以陽性組為參照，濃度為4 μg/mL 的血根堿開始極顯著抑制無乳鏈球菌生物被膜的生成(P<0.01)，血根堿濃度超過16 μg/mL時(shí)無乳鏈球菌333成膜量急劇下降到2.76%以下，與8 μg/mL及以下濃度組差異極顯著(P<0.01)，幾乎不能形成生物被膜。而同樣培養(yǎng)條件下，不同濃度綠原酸對(duì)受試菌株生物被膜生成率維持在較高水平，且不具顯著差異，可見藥物抑制細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)同時(shí)也抑制生物被膜的生成。

圖4 不同濃度血根堿和綠原酸下無乳球菌生物被膜的生成率(n=3)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，36種中草藥在實(shí)驗(yàn)條件相同的情況下抑菌效果存在較大差異，其中血根堿、白屈菜紅堿、厚樸酚、和厚樸酚和大黃酸5種中草藥單體對(duì)三株鏈球菌顯示較強(qiáng)的抑菌效果，黃連素、二氫楊梅素、黃芩素表現(xiàn)出較弱抑菌活性；其余藥物抑菌效果更弱，血根堿作為一種天然的植物源性抗菌生物堿，是植物博落回提取液中的主要成分，生物性能好，毒副作用小[16]，本試驗(yàn)中血根堿的抗菌活性(MIC、MBC分別為8 μg/mL、16 μg/mL)優(yōu)于其他藥物。對(duì)于血根堿的抗菌活性，Wink等[17]在研究生物堿的作用靶位的同時(shí)，還測(cè)定了包含血根堿在內(nèi)的51種生物堿對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌及枯草桿菌的最低抑菌濃度，結(jié)果表明血根堿對(duì)其達(dá)到100%殺滅率的濃度最低。白屈菜紅堿與血根堿均為博落回樹生物堿成分，對(duì)某些細(xì)菌、真菌和病毒有抑制活性[18]，兩者在分子結(jié)構(gòu)上只是個(gè)別基團(tuán)不同，但在抑菌活性上存在差別，有研究表明，白屈菜紅堿對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用大于血根堿；然而作用在大腸桿菌和嗜水氣單胞菌兩種病原菌上時(shí)，血根堿的抑制作用強(qiáng)于白屈菜紅堿，同時(shí)血根堿對(duì)巴氏桿菌有抑制作用，而白屈菜紅堿未表現(xiàn)出抑菌作用[19]。有關(guān)通過抑制細(xì)菌生物被膜來抑制細(xì)菌活性已成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)，陳儉清等[20]發(fā)現(xiàn)丁香葉、大黃和黃連水提物對(duì)生物被膜中的豬鏈球菌具有很好的殺滅作用，史祺云等[21]發(fā)現(xiàn)魚腥草素鈉對(duì)金黃色葡萄球菌浮游菌和早期生物被膜有較好抑制活性；而對(duì)于血根堿抑制細(xì)菌生物被膜研究，同樣有研究表明血根堿在160 μg/mL下能通過生物被膜抑制大腸桿菌、沙門氏菌及金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)[22]。另外本試驗(yàn)中，抑菌實(shí)驗(yàn)與生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)就無乳鏈球菌PBSA0903的MIC結(jié)果存在差異，可能有兩種試驗(yàn)方法中的細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)基體積相關(guān)，可另設(shè)計(jì)試驗(yàn)做討論。

細(xì)菌生物被膜是指細(xì)菌表層能使細(xì)菌之間相互粘附或使細(xì)菌粘附于固體的一種特殊的膜狀結(jié)構(gòu)[23]，其結(jié)構(gòu)物質(zhì)中含有藻酸鹽多糖，能保護(hù)細(xì)菌免受物理或生化因子及機(jī)體免疫的干擾，生物被膜的存在對(duì)人類健康和食品安全存在很大的威脅。有研究發(fā)現(xiàn)生物被膜與細(xì)菌耐藥性存在密切關(guān)系，能使細(xì)菌具有很強(qiáng)的耐藥性和免疫逃逸性[24]。對(duì)于生物被膜抑制消除方式也有過不少報(bào)道，曹鳳嬌[25]對(duì)蘆薈大黃素抑制金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)生物被膜形成試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，蘆薈大黃素通過抑制胞外蛋白和胞外多糖的產(chǎn)生從而抑制生物被膜形成。同樣也有研究顯示，血根堿的加入可抑制藻酸鹽合成的某個(gè)基因，進(jìn)而影響整個(gè)基因調(diào)控過程，減少了藻酸鹽的含量，從而抑制細(xì)菌生物被膜的形成[22]。本試驗(yàn)在以上實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)之上對(duì)無乳鏈球菌進(jìn)行生物被膜構(gòu)建，并測(cè)定不同濃度血根堿對(duì)無乳鏈球菌生物被膜成膜的影響，結(jié)果顯示血根堿對(duì)其生物被膜具有明顯干擾，而相同濃度的綠原酸對(duì)受試菌株生物被膜的生成率幾乎無影響。

中藥抑菌方式除了以單體形式，還可以和其他單體或者某些批準(zhǔn)的抗生素并聯(lián)使用以加強(qiáng)藥效[26-27]。需要指出的是，部分中草藥及其單體雖然具有明顯的抑菌活性，但其抑菌機(jī)理目前尚未完全明了，個(gè)別中草藥體內(nèi)外抗菌效果并不一致[28]，對(duì)于藥物對(duì)生物被膜的作用同樣主要集中于體外研究，這就忽略了體內(nèi)藥物作用的諸多因素，因此需結(jié)合動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)加以比較驗(yàn)證才可以評(píng)價(jià)。本試驗(yàn)僅對(duì)中草藥單體的體外抗菌活性及生物被膜干擾進(jìn)行了研究，若想進(jìn)一步將中藥成分開發(fā)成漁藥，還需對(duì)中草藥的有效成分及其作用機(jī)制在體內(nèi)體外做更深入研究。