雙孢蘑菇培養(yǎng)料理化指標及酶活與其產(chǎn)量相關的多重分析

蔡盼盼，張文強，張昊琳，王清輝，張國慶，陳青君※

（1. 北京農(nóng)學院植物科學技術學院農(nóng)業(yè)應用新技術北京市重點實驗室，北京 102206； 2. 承德興春和農(nóng)業(yè)股份有限公司，灤平 068250； 3. 北京農(nóng)學院生物科學與工程學院農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點實驗室，北京 102206）

0 引 言

雙孢蘑菇味道鮮美，是一種高蛋白、低脂肪、低熱能的健康食品，深受世界各國人民的喜愛[1-2]。中國是雙孢蘑菇生產(chǎn)大國[3]，栽培上以引進荷蘭雙孢蘑菇的栽培模式為主，采用隧道式發(fā)酵技術制作雙孢蘑菇培養(yǎng)料[4]。發(fā)酵包括2個時期：一次發(fā)酵和二次發(fā)酵。一次發(fā)酵期間，物料溫度上升到 80 ℃，使麥秸軟化[5]；二次發(fā)酵時期進行巴氏滅菌處理（60 ℃），隨后在45～50 ℃下調(diào)節(jié)約4～5 d，再將溫度降至約25 ℃[6]。巴氏滅菌殺死一些有害微生物、線蟲、昆蟲等，調(diào)整期發(fā)酵物料中的氨氣逐漸被釋放，大量的有益微生物繁殖，為雙孢蘑菇菌絲的生長做準備。發(fā)酵物料理化性狀直接關系到雙孢蘑菇的品質(zhì)和產(chǎn)量[7]。研究發(fā)現(xiàn)，在一次發(fā)酵期間，小麥秸稈碳水化合物，如纖維素和木聚糖僅在有限的程度上被降解；在二次發(fā)酵期間，高達50%的物料碳水化合物被代謝[5]。二次發(fā)酵期間秸稈的木質(zhì)纖維素成分和微生物生物量發(fā)生很大變化[8-9]，發(fā)酵的過程是微生物菌群演替的過程，微生物產(chǎn)生可降解木質(zhì)纖維素的酶，其中羧甲基纖維素酶（CMC）、纖維二糖酶、葡聚糖酶等參與分解纖維素，木聚糖酶、木糖苷酶、α-阿拉伯糖酶等參與分解半纖維素[10-12]。Jurak等[13]在雙孢蘑菇子實體生長期間的培養(yǎng)料提取物中檢測到內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶和木糖苷酶活性，Patyshakuliyeva等[14]發(fā)現(xiàn)子實體生長期間最豐富的纖維素酶是纖維二糖水解酶、葡聚糖酶和 β-葡萄糖苷酶，半纖維素酶有木聚糖酶、木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、葡萄糖苷酶等，木質(zhì)素降解酶有漆酶、錳過氧化物酶等，在子實體形成階段，纖維素降解 35%，半纖維素降解50%，木質(zhì)素降解40%[5]。高曉靜等報道在物料發(fā)酵期間纖維素和半纖維素的利用率可達到 40%～60%[15]，但木質(zhì)纖維素及其酶活對產(chǎn)量的影響未見報道。Kariaga等研究表明物料發(fā)酵過程中的生物、理化因素影響蘑菇菌絲對培養(yǎng)料的選擇[16]。Sharma和Kilpatrick依據(jù)雙孢蘑菇發(fā)酵物料的質(zhì)量因素預測子實體的潛在產(chǎn)量，研究的數(shù)據(jù)包括物料的含水量、pH值、含氮量、含碳量和銅、鐵和鈉含量等[17]一般常見參數(shù)，結(jié)果表明決定物料質(zhì)量的因素是多個因素的組合，但對木質(zhì)纖維素組分、相關降解酶等參數(shù)與產(chǎn)量的關系沒有提及。

針對前人對雙孢蘑菇發(fā)酵培養(yǎng)料質(zhì)量相關因素的研究結(jié)果，本研究采用隧道式發(fā)酵技術進行雙孢蘑菇培養(yǎng)料的發(fā)酵處置，測定雙孢蘑菇培養(yǎng)料二次發(fā)酵結(jié)束后 13個理化指標及酶活，包括水分、pH值、EC、含碳量、含氮量、木質(zhì)纖維素各組分含量和酶活，以及雙孢蘑菇產(chǎn)量，運用主成分分析、聚類分析和多元回歸分析等多變量分析方法，探究雙孢蘑菇培養(yǎng)料二次發(fā)酵結(jié)束后各理化指標及酶活對產(chǎn)量形成的作用和相對重要性，為評價和篩選雙孢蘑菇高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)料指標提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗采樣于2017年7－12月在河北省承德市灤平縣興春和農(nóng)業(yè)股份有限公司雙孢蘑菇工廠進行。

發(fā)酵原料包括黍草、稻草、麥草、玉米芯、雞糞、石膏、豆粕等，采用隧道式發(fā)酵技術制作發(fā)酵物料，第1～3天將草料、玉米芯、雞糞放入混料池混合后建堆；第4～15天入一次發(fā)酵隧道，中間倒倉3次，并在每次倒倉時根據(jù)當前含水量補充水分至 75%左右[18]；一次倒倉時加入石膏、豆粕；第16～22天轉(zhuǎn)入二次發(fā)酵隧道。二次發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵物料接種雙孢菇菌種，按照工廠化栽培工藝進行菇房管理，栽培菌種為 Sylven A15。試驗所需培養(yǎng)料樣品取自二次發(fā)酵結(jié)束后，從隧道前、中、后斷面各8個點取樣混合；結(jié)合原料來源和配合當?shù)毓S生產(chǎn)，依據(jù)23:1～25:1碳氮比[19]制作原料配方，10批次配方如表1所示；重復3次測定；每批菇房生產(chǎn)期栽培管理一致，通過雙孢蘑菇專用空調(diào)和可編程邏輯控制器（programmable logic controller，PLC）智能化控制系統(tǒng)嚴格控制和調(diào)節(jié)雙孢蘑菇不同生長時期的溫濕度、CO2體積分數(shù)和風壓風量。菌絲生長期間料溫控制在23～25 ℃[20]，空氣達到飽和含水量，CO2體積分數(shù)在0.5%～1%；子實體生長時，菇房里的空氣溫度保持在16～18 ℃[21]，空氣相對濕度85%～95%[18]，CO2體積分數(shù)保持在0.08%以下。菇床面積為900 m2，統(tǒng)計每批菇房產(chǎn)量。

表1 工廠化物料發(fā)酵原料配方Table 1 Formula of factory composting raw material

1.2 試驗方法

采用pH計和電導率儀測定pH值、電導率值。用干燥稱質(zhì)量法測定含水量。用半自動凱氏定氮法[22]測定含氮量。利用灼燒質(zhì)量法測定灰分及含碳量。采用濾袋法[23]測定樣品的纖維素和半纖維素含量。用DNS（3,5-二硝基水楊酸，3,5-Dinitrosalicylic acid）顯色法測定培養(yǎng)料中木聚糖酶酶活、羧甲基纖維素酶（CMC）酶活[24-25]。對硝基苯酚法測定纖維二糖水解酶、β-木聚糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶酶活[26-28]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用 Excel 2007 進行數(shù)據(jù)處理，計算平均值、標準差，再利用SPSS19.0對二次發(fā)酵結(jié)束后培養(yǎng)料各理化性質(zhì)及酶活進行主成分分析、聚類分析，并用多元回歸分析[29]研究其與產(chǎn)量的相關性。

2 結(jié)果與分析

2.1 二次發(fā)酵料理化性質(zhì)和相關酶活與單位面積產(chǎn)量

對10批二次發(fā)酵結(jié)束后的含水量、pH值、EC值、含碳量、含氮量碳氮比等理化性質(zhì)和羧甲基纖維素酶（CMC）、木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纖維二糖酶、纖維素和半纖維素相對含量分別進行測定。由于堆肥期間木質(zhì)素幾乎不降解，分解木質(zhì)素的相關酶活性較低[5]，本次研究結(jié)果未列出。結(jié)果如表2、表3所示。

表2 二次發(fā)酵料理化性質(zhì)與雙孢蘑菇單位面積產(chǎn)量Table 2 Physicochemical properties of secondary fermentation material and yield per unit area of Agaricus bisporus

表3 二次發(fā)酵后培養(yǎng)料纖維素、半纖維素含量及相關酶活Table 3 Content of cellulose and hemicellulose in secondary fermentation materials and related enzyme activities

10批二次發(fā)酵的培養(yǎng)料含水率在65.54%～72.26%之間，pH值7.39～8.16偏弱堿性，EC值在2.05～3.37之間，氮質(zhì)量分數(shù)大多都在1.88%～2.08%，僅1批較低為1.62%，碳氮比大多都在17.10～18.55，有3批碳氮比較低，分別為 14.48:1、15.06:1、16.41:1，總體符合雙孢蘑菇二次發(fā)酵料生產(chǎn)的要求[30-31]；羧甲基纖維素酶活在1.85～2.89 U/mmol之間，木聚糖酶活在 8.24～13.52 U/mmol之間，木糖苷酶活在 23.76～52.77 U/μmol之間，α-阿拉伯呋喃糖苷酶活在82.74～254.85 U/μmol之間，差異較大；α-纖維二糖酶活在 15.81～39.21 U/μmol之間；纖維素質(zhì)量分數(shù)9.40%～19.38%不等，半纖維素質(zhì)量分數(shù)在 5.95%～14.93%；單位面積產(chǎn)量為 18.11～26.42 kg/m2。為進一步明確雙孢蘑菇二次發(fā)酵培養(yǎng)料各種酶活、理化性狀與產(chǎn)量的關系，采用主成分分析、聚類分析、多元回歸分析進一步分析。

2.2 主成分分析

主成分分析（principal component analysis，PCA）主要通過降維的方法，用較少的指標來代替和綜合反映原來較多的信息[32]，提取出數(shù)據(jù)要表達的信息的主要成分。特征值的大小代表了矩陣正交化之后所對應特征向量對于整個矩陣的貢獻程度。以特征值大于1為標準[32]在13個參數(shù)中提取出4個主成分，累積貢獻率達84.04%，可代表原始因子所代表的大部分信息。因子載荷矩陣是各個原始變量的因子表達式的系數(shù)，代表提取的公因子對原始變量的影響程度。根據(jù)0.5原則，主成分1包括纖維素質(zhì)量分數(shù)、半纖維素質(zhì)量分數(shù)、碳質(zhì)量分數(shù)、碳氮比，貢獻率為31.18%，主要是與碳水化合物的變化的相關參數(shù)；主成分2包括羧甲基纖維素酶、木糖苷酶、α-纖維二糖酶，貢獻率為18.45%，CMC、α-纖維二糖酶主要分解纖維素，木糖苷酶外切木聚糖主鏈，成分 2與培養(yǎng)料中纖維素和少量半纖維素降解有關；主成分3包括EC值、氮質(zhì)量分數(shù)，貢獻率為18.34%，培養(yǎng)料中的氮源經(jīng)過微生物的代謝轉(zhuǎn)化為可供蘑菇菌絲利用的形態(tài)，EC值反應了培養(yǎng)料中可溶性鹽濃度，過高則影響菌絲對礦質(zhì)元素的吸收，皆為影響發(fā)酵物料質(zhì)量的重要指標；主成分 4主要是含水率、木聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、pH值，貢獻率為16.08%，含水率的多少影響料堆中氧氣的流通和微生物的活動，間接影響秸稈的降解，木聚糖酶在分解木聚糖中起主要作用，α-阿拉伯呋喃糖苷酶則分解木聚糖側(cè)鏈，pH值影響培養(yǎng)料中微生物的生長，主成分4在降解半纖維素中起主要作用（表4）。

表4 主成分因子載荷矩陣Table 4 Principal component factor load matrix

2.3 聚類分析

聚類分析（CA）依據(jù)事物的數(shù)值特征觀察樣品間的親疏關系，而樣品間的親疏關系由樣品之間的距離衡量，一旦定義了樣品間的距離，就把距離近的樣品歸為一類[32]。用SPSS19.0計算13個指標之間的歐氏距離[33-34]，將各樣本的距離映射到0～25之間，構(gòu)建聚類圖（圖1）。

圖1 聚類分析樹狀圖Fig. 1 Cluster analysis tree

由圖1看出，當距離臨界值取18時，成分因子聚為4類。第1類：纖維素質(zhì)量分數(shù)、半纖維素質(zhì)量分數(shù)、碳質(zhì)量分數(shù)、碳氮比、木糖苷酶活、α-纖維二糖酶活、羧甲基素纖維素酶（CMC）活性，降解纖維素的CMC、α-纖維二糖酶以及降解少量半纖維素的木糖苷酶活性影響纖維素、半纖維素降解，從而影響纖維素、半纖維素的質(zhì)量分數(shù)，即第一類與碳水化合物的變化有關；第 2類：EC值、氮質(zhì)量分數(shù)，與主成分分析的成分3相一致，為影響二次發(fā)酵培養(yǎng)料質(zhì)量的重要指標；第3類：含水率、木聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶，在降解半纖維素中起主要作用；第4類：pH值，培養(yǎng)料中適宜的酸堿環(huán)境對微生物和雙孢蘑菇菌絲的生長有重要影響。

2.4 多元回歸分析

逐步回歸分析是分別把每一個變量都選入模型中，每次都保留系數(shù)顯著水平最高的那個變量，剔除不顯著的變量，通過多次的選入和剔除最終得到系數(shù)的顯著的回歸方程。隨機選取9批樣品，以二次發(fā)酵后的13個指標為自變量，以單位面積產(chǎn)量為因變量進行逐步回歸分析，得到的最優(yōu)回歸方程為：

單位面積產(chǎn)量(kg/m2)=10.134+2.762×CMC 酶活(U/mmol)+1.248×木聚糖酶酶活(U/mmol)-0.566×纖維素質(zhì)量分數(shù)×100%（R=0.969，F(xiàn)=25.857，P=0.002）

模型擬合優(yōu)度系數(shù)為0.969，接近于1，擬合優(yōu)度較高，方差檢驗 F=25.857對應的 P＜0.05，回歸方程顯著成立。由回歸方程模型分析可知，二次發(fā)酵結(jié)束后的木聚糖酶酶活、羧甲基纖維素酶活、纖維素含量對雙孢蘑菇產(chǎn)量有密切影響，木聚糖酶酶活、羧甲基纖維素酶活與雙孢蘑菇產(chǎn)量存在正的線性關系，纖維素質(zhì)量分數(shù)與雙孢蘑菇產(chǎn)量存在負的線性關系。將剩下的 1批樣品CMC酶活2.25 U/mmol、纖維素質(zhì)量分數(shù)13.66%、木聚糖酶酶活 13.21 U/mmol帶入計算單位面積產(chǎn)量為25.10 kg/m2，與實際產(chǎn)量26.42 kg/m2相差不大，相對誤差絕對值不到5%，說明回歸方程的預測效果較好。

3 討 論

在實際生產(chǎn)過程中，各個階段培養(yǎng)料的理化性質(zhì)是蘑菇種植者判斷其優(yōu)劣的重要依據(jù)[35]。本研究采取10批不同原料通過二次發(fā)酵制造雙孢磨菇培養(yǎng)料，在所測的各理化性質(zhì)中，聚類分析的EC值、氮質(zhì)量分數(shù)的分類與主成分分析一致，二者在主成分分析中貢獻率達18.34%，為二次發(fā)酵料中的重要檢測指標。微生物經(jīng)過發(fā)酵作用將培養(yǎng)料中的氮源轉(zhuǎn)化，供雙孢蘑菇菌絲生長，氮質(zhì)量分數(shù)的高低都會影響子實體的質(zhì)量和產(chǎn)量，而EC值的大小影響菌絲對鹽離子的吸收。聚類分析中pH值也占據(jù)重要的一類，是影響雙孢蘑菇產(chǎn)量的關鍵因素。pH值的高低影響堆肥中微生物和雙孢蘑菇菌絲的生長，大多數(shù)微生物最適宜生長的環(huán)境為中性或弱堿性，二次發(fā)酵后物料pH值在7.2～7.7，培養(yǎng)料內(nèi)菌絲發(fā)滿后pH值在6.2～6.6時最適宜雙孢菇菌絲的生長[36]。本試驗10批料pH值在7.39～8.16范圍，EC值在2.05～3.37之間，氮質(zhì)量分數(shù)在1.88～2.08%，堆肥質(zhì)量符合雙孢蘑菇的生長要求。

堆肥中酶的活性影響纖維素、半纖維素的降解[37]，這些大分子物質(zhì)必須經(jīng)相應的酶分解成葡萄糖、果糖等單糖類和小分子化合物后才能被吸收利用，為雙孢蘑菇生長提供所需的碳源。有研究發(fā)現(xiàn)纖維素、半纖維素降解與酶活性變化有關，酶活性高降解速率就快，酶活性低降解速率就慢[38-39]。但關于酶活作為培養(yǎng)料指標的重要性和占有的份量少有報道。本研究表明，對纖維素降解起作用的 CMC、α-纖維二糖酶和分解少量半纖維素的木糖苷酶在主成分分析中貢獻率為18.45%，對降解半纖維素中起主要作用的木聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶與含水率、pH在主成分分析中貢獻率為16.08%。因此，酶活可作為二次發(fā)酵料質(zhì)量重要的檢測指標。

碳水化合物是蘑菇利用的主要營養(yǎng)物質(zhì)。本研究的聚類分析中，纖維素質(zhì)量分數(shù)、半纖維素質(zhì)量分數(shù)與碳質(zhì)量分數(shù)、碳氮比以及少量纖維素降解酶歸為一類，在主成分分析中纖維素質(zhì)量分數(shù)、半纖維素質(zhì)量分數(shù)、碳質(zhì)量分數(shù)、碳氮比作為主成分1貢獻率達31.176%，足以說明其重要性。

含水率的多少影響發(fā)酵微生物的活力，進而影響酶的活性。發(fā)酵成熟后，培養(yǎng)料的含水率應達到 67～70%[40]，在63.5%時，嗜熱微生物量最多，含水率的增加或降低都會使其減少[41]。本研究中主成分 4主要是含水率、木聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、pH值，貢獻率為16.08%，聚類分析也將含水率、木聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶歸為一類，均說明含水率的重要性以及與降解半纖維素的密切關系。

主成分和聚類 2種分類方式的結(jié)果中也存在不同的部分。在與碳水化合物變化有關的分類上，主成分分析的結(jié)果中含有纖維素質(zhì)量分數(shù)、半纖維素質(zhì)量分數(shù)、碳質(zhì)量分數(shù)、碳氮比，聚類分析分類結(jié)果中除了這 4個指標外還有CMC、α-纖維二糖酶等少量酶；主成分分析的主成分4中包括含水率、木聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、pH值，而聚類分析將含水率、木聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶分為一類，將pH值單獨分為一類。2種分類方式運算方式不同造成了分類結(jié)果的不完全相同。主成分分析將變量通過線性變換轉(zhuǎn)換為兩兩不相關的變量，方差最大的一組線性組合稱為第 1主成分，次大的一組稱為第 2主成分，依次類推。各主成分的貢獻率反應了原始數(shù)據(jù)的信息量占全部信息量的比例，分析結(jié)果較客觀、合理。但要保證提取的主成分累計貢獻率達到較高水平。聚類分析是按照選定的方法計算每兩類之間的聚類統(tǒng)計量，將關系最為密切的兩類合為一類，再與最相似的變量或小類合并，有時實踐中會發(fā)現(xiàn)他們在數(shù)據(jù)中有緊密的關系，但事物之間卻無任何內(nèi)在聯(lián)系。聚類分析本身卻無法識別這類錯誤。聚類分析的結(jié)果直觀簡明，適合對樣本的簡單分類；主成分分析適用于對目標降維，便于數(shù)據(jù)的進一步觀察和處理。在本研究中，主成分分析的結(jié)果更為可信。

單位面積產(chǎn)量與二次發(fā)酵料的13個指標進行多元回歸分析的結(jié)果表明：羧甲基纖維素酶活、木聚糖酶酶活與雙孢蘑菇產(chǎn)量存在正線性關系，纖維素質(zhì)量分數(shù)與雙孢蘑菇產(chǎn)量存在負線性關系。纖維素、半纖維素被降解成可供菌絲生長利用的小分子物質(zhì)，與雙孢蘑菇子實體的生長及產(chǎn)量有密切的關系。實際生產(chǎn)中可以采用測定羧甲基纖維素酶活、木聚糖酶酶活和纖維素質(zhì)量分數(shù)來評價發(fā)酵料的質(zhì)量，并預測產(chǎn)量。

4 結(jié) 論

1）通過主成分分析在二次發(fā)酵料的 13個指標中提取出 4個主成分，貢獻率分別為 31.176%、18.45%、18.34%、16.08%，累積貢獻率達84.04%，可代表原始因子所代表的大部分信息。4個主成分可分為：碳水化合物因子；主要的纖維素降解酶類；EC值、氮質(zhì)量分數(shù)；主要的半纖維素降解酶類。其結(jié)果客觀合理，更為可信。

2）聚類分析在距離臨界值取18時將13個指標聚為4類：碳水化合物變化因子；EC值、氮質(zhì)量分數(shù)；半纖維素降解酶類；pH值。其分類結(jié)果與主成分分析結(jié)果不完全相同但都將纖維素質(zhì)量分數(shù)、半纖維素質(zhì)量分數(shù)、碳質(zhì)量分數(shù)、碳氮比以及少量纖維素降解酶等碳水化合物因子歸為一類。

3）利用多元回歸分析建立二次發(fā)酵培養(yǎng)料指標與單位面積產(chǎn)量的關系式，單位面積產(chǎn)量與CMC酶活和木聚糖酶酶活呈正線性關系，與纖維素含量呈負線性關系（回歸模型R=0.969，P＜0.05），擬合效果較好，驗證相對誤差絕對值＜5%。實際生產(chǎn)中可以采用測定二次發(fā)酵培養(yǎng)料的羧甲基纖維素酶活、木聚糖酶酶活和纖維素質(zhì)量分數(shù)來預測雙孢蘑菇可能的產(chǎn)量。